徐潤強(qiáng) 劉宇平 張海良 劉海盛 劉鈺君 姚金科

【摘要】 目的：研究血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）-A及磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義。方法：選取2013年9月-2015年9月本院收治的結(jié)直腸癌患者80例作為觀察組，同時(shí)切取患者癌旁正常腸黏膜組織作為對照組。分別采用免疫組化法檢測癌組織和癌旁組織VEGF-A、PI3K及AKT表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)比較兩組三指標(biāo)表達(dá)陽性率。單因素分析結(jié)直腸癌組織中VEGF-A、PI3K及AKT表達(dá)水平與患者臨床病理資料的相關(guān)性，同時(shí)Spearman相關(guān)性分析VEGF-A與PI3K及AKT表達(dá)相關(guān)性。術(shù)后隨訪5年，比較VEGF-A、PI3K及AKT陽性和陰性表達(dá)患者生存率。結(jié)果：觀察組VEGF-A、PI3K及AKT表達(dá)陽性率均明顯高于對照組（P<0.05）。結(jié)直腸癌VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達(dá)患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;結(jié)直腸癌VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達(dá)患者TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)直腸癌組織中VEGF-A表達(dá)與PI3K、AKT表達(dá)均呈明顯正相關(guān)（rs=0.625、0.517，P=0.001）。結(jié)直腸癌中VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達(dá)患者5年生存率均明顯低于陰性表達(dá)患者（P<0.05）。結(jié)論：結(jié)直腸癌組織中VEGF-A、PI3K及AKT均存在高表達(dá)現(xiàn)象，與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化及浸潤深度呈明顯相關(guān)性，且患者生存期更短，可能參與結(jié)直腸癌病情發(fā)生發(fā)展，對臨床診斷及治療具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】 VEGF-A PI3K/AKT通路 結(jié)直腸癌 表達(dá) 臨床意義

[Abstract] Objective： To study the expression and clinical significance of vascular endothelial growth factor （VEGF） -A and phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K） /protein kinase B （AKT） pathway in colorectal cancer. Method： From September 2013 to September 2015， 80 patients with colorectal cancer were selected as the observation group， at the same time the normal intestinal mucosal tissue was cut off as the control group. The VEGF-A， PI3K and AKT expression levels of cancer tissues and adjacent tissues were detected by immunohistochemistry， the positive expression rate of three indexes in two groups were counted and compared. Univariate analysis of the correlation between VEGF-A， PI3K and AKT expression in colorectal cancer and clinicopathological data， the correlation of VEGF-A with PI3K and Akt expression was by Spearman correlation analysis. The patients were followed up for 5 years， the survival rate of VEGF-A， PI3K and AKT positive and negative expression patients were compared. Result： The positive rate of VEGF-A， PI3K and AKT expression in the observation group were significantly higher than those in the control group （P<0.05）. There were no significant differences in sex， age， tumor diameter and tumor site of colorectal cancer VEGF-A， PI3K and AKT positive expression patients （P>0.05）; there were significant differences in stage， differentiation degree， lymph node metastasis and invasion depth of colorectal cancer VEGF-A， PI3K and positive expression patients （P>0.05）. There were significant positive correlation between VEGF-A expression and PI3K， AKT expression in colorectal cancer （rs=0.625， 0.517， P=0.001）. The survival rate of colorectal cancer VEGF-A and PI3K and AKT positive expression patients were significantly lower than those of negative expression patients （P<0.05）. Conclusion： VEGF-A， PI3K and AKT in colorectal cancer tissues are highly expressed， and shows significant correlation with tumor stage， lymph node metastasis， differentiation and depth of invasion， it also reduces survival， may be involved in the development of colorectal cancer， it is of great significance for clinical diagnosis and treatment.

[Key words] VEGF-A PI3K/AKT pathway Colorectal cancer Expression Clinical significance

First-authors address： Zengcheng District Peoples Hospital of Guangzhou City， Guangzhou 511300， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.03.001

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，是指大腸上皮內(nèi)起源的腫瘤，其發(fā)病病因尚未明確定論，可能與大腸息肉、炎性疾病、生活飲食及遺傳等諸多因素有關(guān)，在我國具有較高的發(fā)病率和致死率，分別高居所有惡性腫瘤的第3位和第5位，且發(fā)病率有逐年升高趨勢[1]。結(jié)直腸癌早期常無特異性癥狀，隨著病情進(jìn)展可出現(xiàn)排便習(xí)慣改變、腹瀉便秘、便血及腹痛等癥狀，多數(shù)患者早期很難及時(shí)診斷，加之此腫瘤惡性程度較高，出現(xiàn)淋巴結(jié)或血行轉(zhuǎn)移時(shí)間較早，造成其病死率常年居高不下。研究指出，雖目前手術(shù)、放化療、靶向治療等手段不斷改進(jìn)，結(jié)直腸癌患者五年生存率仍僅約40.0%，整體預(yù)后質(zhì)量仍不滿意，因此了解其發(fā)病機(jī)制以提高早期診治效率，已成為臨床醫(yī)師需重點(diǎn)解決的目標(biāo)[2]。伴隨結(jié)直腸癌分子生物學(xué)機(jī)制研究深入，多種基因、酶類及信號通路在其發(fā)生發(fā)展中受到高度關(guān)注。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）-A是一種具有高活性的功能性糖蛋白，具有誘導(dǎo)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、新血管生成及通透性增加等功能，已被證實(shí)為多種惡性腫瘤的正向調(diào)節(jié)因子[3]。研究指出，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)，其異?；罨髮?xì)胞凋亡抑制明顯，而加速細(xì)胞增殖、分化及轉(zhuǎn)移速度，并可促進(jìn)腫瘤新血管生成，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲[4]。目前VEGF-A與PI3K/AKT通路在結(jié)直腸癌中研究相對較少，而研究其對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展影響，對腫瘤早期診斷、藥物治療靶點(diǎn)開發(fā)及預(yù)后監(jiān)測等具有重要意義。因此本研究筆者就基于此課題展開保證，旨在為臨床提供指導(dǎo)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年9月-2015年9月廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌根治術(shù)患者

80例為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合結(jié)直腸癌相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，且經(jīng)術(shù)后病理學(xué)診斷證實(shí);均接受手術(shù)治療且術(shù)前無放化療、靶向治療等治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)心腦血管、肝腎肺等實(shí)質(zhì)性臟器組織疾病;合并胃癌、肝癌等其他類型惡性腫瘤;合并HIV等嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病;臨床病理資料不完整或標(biāo)本欠理想。同時(shí)切取患者癌旁正常腸黏膜組織（距離腫瘤≥5 cm）作為對照組。80例患者，男45例，女35例;年齡20～87歲，平均（56.28±11.31）歲，腫瘤部位：結(jié)腸49例，直腸31例。本研究經(jīng)院內(nèi)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 免疫組化法檢測：80例結(jié)直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織4%中性緩沖甲醛固定，常規(guī)制作石蠟包埋組織，石蠟組織5 μm厚度連續(xù)切片，脫蠟至水，抗原修復(fù)自然冷卻后在醫(yī)用雙氧水下浸泡10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水充分洗凈，置于PBS中浸泡5 min，分別滴加VEGF-A（abcam編號ab1316）及PI3K（abcam編號ab140307）及AKT抗體（abcam編號ab8805），隨后置于4 ℃冰箱孵育過夜，PBS漂洗后滴加免疫顯色試劑（丹麥DaKO，批號20077835B），室溫環(huán)境孵育20 min，PBS漂洗后滴加以DAB顯色，顯微鏡下控色，依次蘇木素復(fù)染、脫水、透明及封片，高年資病理醫(yī)師于顯微鏡下觀察結(jié)果。結(jié)果判讀：采用雙盲法進(jìn)行讀片，癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，未出現(xiàn)則為陰性細(xì)胞，采用染色程度與染色細(xì)胞比例評分之和作為陽性標(biāo)準(zhǔn)，其中染色程度：無染色（0分）、淡黃色（1分）、黃色（2分）及棕黃色（3分），陽性細(xì)胞比例：≤5.0%（0分）、6.0%～10.0%（1分）、11.0%～20.0%（2分）、21.0%～50.0%（3分）及>50.0%（4分），兩項(xiàng)得分相乘，總得分≤2分為陰性表達(dá)、3～4分為弱陽性表達(dá)（+），6～8分為中等強(qiáng)度陽性表達(dá)（++），9～12分為中等強(qiáng)度陽性表達(dá)（+++）[6]。將中等強(qiáng)度以上表達(dá)定義為本研究的陽性表達(dá)病例，不表達(dá)或弱陽性定義為本研究的陰性表達(dá)病例，計(jì)算陽性率。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組標(biāo)本組織中VEGF-A、PI3K及AKT表達(dá)陽性率;單因素分析結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤部位、TNM分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理資料相關(guān)性;所有病例隨訪時(shí)間截止為2020年10月1日，比較結(jié)直腸癌VEGF-A、PI3K及AKT陽性和陰性表達(dá)患者5年生存率，并繪制生存曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（x±s）表示;計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。并采用單因素分析各指標(biāo)相關(guān)性，相關(guān)性分析采用Spearman法，生存分析采用Kaplan-Meier生存分析法比較，并繪制生存曲線。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組標(biāo)本組織中VEGF-A、PI3K及AKT表達(dá)陽性率比較 VEGF-A、PI3K及AKT在觀察組結(jié)直腸癌組織中大部分呈中等和強(qiáng)陽性表達(dá)（圖1），對照組中的癌旁正常腸黏膜大部分為陰性表達(dá)或弱陽性表達(dá)，無強(qiáng)陽性表達(dá)。觀察組VEGF-A、PI3K及AKT表達(dá)陽性率均明顯高于對照組（P<0.05），見表1。

2.2 VEGF-A、PI3K及AKT表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達(dá)患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;結(jié)直腸癌VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達(dá)患者TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 VEGF-A表達(dá)與PI3K、AKT表達(dá)的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，結(jié)直腸癌組織中VEGF-A表達(dá)與PI3K、AKT表達(dá)均呈顯著正相關(guān)（rs=0.625、0.517，P=0.001、0.001）。

2.4 結(jié)直腸癌中不同VEGF-A、PI3K及AKT表達(dá)情況患者5年生存率比較 術(shù)后隨訪5年，結(jié)直腸癌患者中，VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達(dá)患者5年生存例數(shù)分別為21、24、23例，5年生存率分別為36.21%、38.09%、38.33%，陰性表達(dá)患者5年生存例數(shù)分別為17、14、15例，5年生存率分別為77.27%、82.35%、75.00%，結(jié)直腸癌中不同VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達(dá)患者5年生存率均明顯低于陰性表達(dá)患者（字2=9.36、7.43、6.67，P<0.05），見圖2。

3 討論

研究指出，結(jié)直腸癌發(fā)病受多種因素影響，包括不良生活飲食習(xí)慣、遺傳易感性及腸道良性病變等因素，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多因素、多因子、多步驟及多階段參與，其中癌基因激活與抑癌基因抑制其重要作用[7]。目前，結(jié)直腸癌可采用手術(shù)、放化療及靶向治療等措施，但其病情整體緩解率偏低，仍具有較高的疾病復(fù)發(fā)率，總體治療有效率不足35.0%[8]，因此深入研究結(jié)直腸癌發(fā)病分子生物學(xué)機(jī)制，可對早期診斷、治療及藥物研發(fā)提供重要指導(dǎo)。VEGF是一種高度特異性促血管內(nèi)皮生長因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及新血管生成和通透性增加等作用，基礎(chǔ)研究證實(shí)[9]，VEGF在癌細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲和黏附過程中發(fā)揮重要作用，包括促進(jìn)癌細(xì)胞入血轉(zhuǎn)移和提高癌組織血流灌注，導(dǎo)致癌細(xì)胞活性增強(qiáng)和轉(zhuǎn)移侵襲，最終造成病情發(fā)展惡化。VEGF-A是屬于VEGF家族成員之一，多由炎性浸潤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌，正常機(jī)體內(nèi)幾乎無表達(dá)，但高表達(dá)于腫瘤等血供豐富和代謝旺盛組織，屬于強(qiáng)效促腫瘤細(xì)胞和血管生長因子[10]。VEGF-A基因位于第6號染色體6p12位置，其中VEGF-A在新血管生成量多的組織表達(dá)較高，包括胎盤、幾乎所有腫瘤、炎性疾病及缺血性心臟病等。實(shí)驗(yàn)研究表明，VEGF-A能改變樹突狀細(xì)胞功能，抑制免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞攻擊，并可促進(jìn)腫瘤新血管生成，此外還可能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）-2表達(dá)，促進(jìn)淋巴管形成及腫瘤細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移[11]。最新有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-A在腸癌中多呈現(xiàn)高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤組織新血管生成和通透性增加，參與癌細(xì)胞增殖和侵襲擴(kuò)散。朱凱旋等[12]研究指出，VEGF-A在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM高分期患者中表達(dá)更高，參與患者病情發(fā)展及轉(zhuǎn)移侵襲。本研究結(jié)果顯示，癌組織中VEGF-A表達(dá)陽性率明顯高于癌旁組織，且與結(jié)直腸癌患者的TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度密切相關(guān)，提示VEGF-A異常高表達(dá)參與結(jié)直腸癌患者病情發(fā)生進(jìn)展。

PI3K/AKT信號通路是體內(nèi)重要的調(diào)控通路，正常情況下參與多種細(xì)胞基本功能，包括細(xì)胞生長增殖、凋亡、代謝及轉(zhuǎn)錄翻譯等，但該通路異?；罨罂梢种萍?xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和新血管生成，參與多種癌癥、糖尿病等發(fā)生發(fā)展[13]。近年來，結(jié)直腸癌患者PI3K/AKT信號通路異?；罨芯枯^多，已被證實(shí)其具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成，以及抑制癌細(xì)胞凋亡和調(diào)控癌細(xì)胞增殖周期等多種功能。Waniczek等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路異常活化后AKT可磷酸化mTOR、4EBP1等分子，向癌細(xì)胞傳達(dá)生存信號，并能抑制不依賴p53途徑的細(xì)胞凋亡。有研究指出，肝細(xì)胞生長因子（HGF）可經(jīng)PI3K/AKT通路促進(jìn)VEGF表達(dá)，當(dāng)PI3K/AKT通路異?；罨?，導(dǎo)致VEGF高表達(dá)，并能經(jīng)NF-κB和β-catenin表達(dá)，最終誘導(dǎo)結(jié)直腸癌血管形成和轉(zhuǎn)移[15]。結(jié)直腸癌實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路異常活化可誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）和周期蛋白依賴性激酶（CDKs）高表達(dá)，抑制p27KIP1等基因表達(dá)，縮短細(xì)胞周期G1期時(shí)間，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，同時(shí)還能上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP），降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)，增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，參與結(jié)直腸癌病情發(fā)生發(fā)展[16]。但也有研究指出，PI3K/AKT信號通路異?；罨瘍H為結(jié)直腸癌發(fā)病的早期事件，早期PI3K、AKT蛋白表達(dá)即處于高水平，與病情進(jìn)展和預(yù)后無明顯關(guān)系[17-18]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織PI3K和AKT表達(dá)陽性率明顯高于癌旁組織，同時(shí)發(fā)現(xiàn)TNM分期Ⅲ期+Ⅳ期、分化越低、淋巴結(jié)存在轉(zhuǎn)移及浸潤深度越深患者的PI3K和AKT表達(dá)陽性率明顯更高，且術(shù)后隨訪5年，結(jié)直腸癌中VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達(dá)患者5年生存率均明顯低于陰性表達(dá)患者（P<0.05）。PI3K/AKT信號通路不僅參與結(jié)直腸癌發(fā)病，且對病情發(fā)生發(fā)展和預(yù)后起著重要作用[19]。且本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中VEGF-A表達(dá)與PI3K和AKT均呈明顯正相關(guān)。VEGF-A與PI3K/AKT通路可能在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中起到協(xié)同效應(yīng)[20]。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中VEGF-A、PI3K及AKT均存在高表達(dá)現(xiàn)象，且與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及浸潤深度呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，且患者生存期更短，三者在結(jié)直腸癌中高表達(dá)具有密切相關(guān)性，可能參與結(jié)直腸癌病情發(fā)生發(fā)展，對臨床診斷及治療具有重要意義。

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（收稿日期：2020-11-13） （本文編輯：程旭然）