李 尚，徐佳雯，張 斐，2*

1 徐州醫(yī)科大學 新藥研究與臨床藥學重點實驗室，徐州 221000；2 江蘇福鋅雨醫(yī)藥科技有限公司，南京 210033

琥珀酸曲格列汀是一種二肽基肽酶Ⅳ（DPP-4）抑制劑[1]，通過選擇性、持續(xù)性抑制DPP-4，進而抑制胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素分泌多肽（GIP）的滅活，提高內(nèi)源性GLP-1 和GIP 的水平，促進胰島β 細胞釋放胰島素，同時抑制胰島α 細胞分泌胰高血糖素，從而提高胰島素水平，降低血糖[2]。該藥是由日本武田公司和Furiex 公司聯(lián)合研發(fā)的全球首個1 周1 次的長效口服降糖藥（商品Zafatek）[3]，與目前市場上1 日1 次的短效產(chǎn)品相比，有望大幅度改善患者的便利性和依從性，并可潛在提高血糖控制，減少糖尿病并發(fā)癥。

本研究根據(jù)琥珀酸曲格列汀的合成工藝（見圖1）、降解途徑并結合強制降解試驗的結果[4]，確定了本品可能存在的雜質(zhì)有9 個（結構見圖2），即雜質(zhì)Ⅰ～Ⅸ。有關物質(zhì)是藥品質(zhì)量標準中重要的一項檢測指標，通常采用高效液相色譜法（HPLC）進行測定，在各國藥典中大多產(chǎn)品質(zhì)量標準中采用外標法、加校正因子主成分對照法等對雜質(zhì)進行定量分析，以便確定產(chǎn)品的有關物質(zhì)變化趨勢，判斷產(chǎn)品質(zhì)量。本試驗建立了高效液相色譜法同時對琥珀酸曲格列汀及已知的9 個雜質(zhì)進行分離和含量檢測。

1 儀器及藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent 1260 infinity Ⅱ高效液相色譜儀；Mettler ME55 電子天平（精度0.01 mg）。

1.2 藥品與試劑

琥珀酸曲格列?。ê?9.8%，批號20200401、20200402、20200421，江蘇福鋅雨醫(yī)藥科技有限公司）；雜質(zhì)Ⅰ（純度97.3%，批號C19005-10-7）、雜質(zhì)Ⅱ（純度95.8%，批號C19005-8-3）、雜質(zhì)Ⅲ（純度96.8%，批號C19005-13-6）、雜質(zhì)Ⅳ（純度97.9%，批號C19005-2-11）、雜質(zhì)Ⅵ（純度97.3%，批號190627-2）、雜質(zhì)Ⅶ（純度96.1%，批號190705-1），均自制；雜質(zhì)Ⅴ（純度96.0%，批號14HW7302-F+1+06940A14）、雜質(zhì)Ⅷ（純度95.6%，批號14HW7302-I+3+069481316）、雜質(zhì)Ⅸ（純 度97.4%，批 號14HW7302-J+3+069501314）均為南京威諾德醫(yī)藥技術有限公司產(chǎn)品。

磷酸、乙腈為色譜級；鹽酸、過氧化氫、氫氧化鈉均為分析純；實驗用水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 雜質(zhì)對照品混合儲備液取雜質(zhì)Ⅰ～Ⅸ對照品適量，加乙腈溶解并稀釋制成每毫升中含各雜質(zhì)100 μg 的溶液。

2.1.2 系統(tǒng)適用性試驗溶液取雜質(zhì)對照品混合儲備液和琥珀酸曲格列汀適量，加0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解并稀釋制成每毫升中含各雜質(zhì)10 μg和琥珀酸曲格列汀500 μg 的溶液。

圖1 琥珀酸曲格列汀合成路線圖

圖2 琥珀酸曲格列汀及其有關物質(zhì)結構圖

2.1.3 供試品溶液稱取琥珀酸曲格列汀適量，加0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解并稀釋成每毫升中約含琥珀酸曲格列汀500μg 的溶液，濾過，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Welch Utimate AQ C18（4.6mm×250mm，5 μm）；流動相A：0.1%磷酸溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫：0～3 min、10%B，3～8 min、10%～15%B，8～18 min、15%～25%B，18～20 min、25%B，20～40 min、25%～65%B，40～40.1 min、65%～10%B，40.1～45 min、10%B；柱溫：35 ℃；檢測波長：230 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。

2.3 方法學驗證

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗取“2.1.2”項下系統(tǒng)適用性試驗溶液，按“2.2”色譜條件進樣并記錄色譜圖，見圖3；二極管陣列檢測器（DAD）光譜圖見圖4。在試驗結果中，琥珀酸曲格列汀和9 個雜質(zhì)的分離度均大于1.5，滿足分離要求，理論塔板數(shù)均大于13000。

2.3.2 破壞性試驗精密稱定琥珀酸曲格列汀各10 mg（n=5）于20 mL 量瓶內(nèi)進行強制降解試驗：①酸破壞：精密量取0.2 mol·L-1鹽酸溶液1 mL，于室溫下破壞2 h 后，加入0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解稀釋并定容至刻度，即得；②堿破壞：精密量取0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液1 mL，于室溫下破壞4 h 后，加入0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解稀釋并定容至刻度，即得；③氧化破壞：精密量取3%過氧化氫溶液1 mL，于室溫下避光破壞5 天后，加入0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解稀釋并定容至刻度，即得；④高溫破壞：取樣品適量，于60 ℃條件下破壞5 天后，加入0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解稀釋并定容至刻度，即得；⑤光照破壞：取樣品適量，于（4500±500）Lx 條件下破壞5 天后，加入0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解稀釋并定容至刻度，即得。分別取上述破壞溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定并記錄色譜圖，見圖5。

結果表明，各降解產(chǎn)物峰與主成分峰均分離良好，分離度均大于1.5，且空白溶劑對雜質(zhì)檢出沒有干擾，表明該法專屬性良好，同時對樣品進行物料平衡計算，各條件下破壞樣品的總峰面積均在95.0%～105.0%，物料基本守恒，試驗數(shù)據(jù)見表1。

2.3.3 線性關系考察及校正因子測定稱取雜質(zhì)Ⅰ～Ⅸ和琥珀酸曲格列汀適量，加0.1%磷酸-乙腈（85∶15）稀釋成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、8.0、10.0 μg·mL-1的單一成分溶液，取上述溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度X（μg·mL-1）為橫坐標，峰面積Y 為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程，用琥珀酸曲格列汀線性回歸方程的斜率與各雜質(zhì)線性回歸方程斜率比值計算各雜質(zhì)的校正因子，見表2。

圖3 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖

圖4 二極管陣列檢測器光譜圖

圖5 專屬性試驗HPLC 色譜圖

結果表明，雜質(zhì)Ⅰ～Ⅸ和琥珀酸曲格列汀線性關系均良好，r2≥0.9999；雜質(zhì)Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ的校正因子在0.9～1.1，測定雜質(zhì)含量時可采用不加校正因子的主成分對照法；而雜質(zhì)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ在測定含量時則需要使用校正因子進行校正。

表1 物料平衡數(shù)據(jù)

2.3.4 檢測限及定量限測定取“1.2”項下系統(tǒng)適用性試驗溶液，加0.1%磷酸-乙腈（85∶15）逐級稀釋后，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，按信噪比S/N=3 定為檢測限，S/N=10 定為定量限。見表2。

表2 琥珀酸曲格列汀與雜質(zhì)Ⅰ～Ⅸ的線性關系、校正因子、檢測限及定量限

2.3.5 精密度試驗

進樣精密度：按照“2.1.2”項下方法配制系統(tǒng)適用性試驗溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。試驗表明，琥珀酸曲格列汀和雜質(zhì)Ⅰ～Ⅸ峰面積的RSD 值分別為0.1%、0.1%、0.1%、0.2%、0.2%、0.4%、0.1%、0.3%、0.2%、0.9%，結果均＜1.0%，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取本品，按照“2.1.2”項下方法，平行配制6 份系統(tǒng)適用性試驗溶液，照“2.2”項下色譜條件進樣測定，利用加校正因子的主成分對照法[5]分別計算各雜質(zhì)的含量，結果表明，6 份樣品的雜質(zhì)含量基本一致，各雜質(zhì)和總雜RSD 值均在1.0%以內(nèi)，表明本方法重復性良好。

2.3.6 回收率試驗按照“2.1.3”項下方法配制9份供試品溶液，精密量取“2.1.1”項下雜質(zhì)對照品混合儲備液1、2、3 mL 各3 份，分別加入到上述9 份供試品溶液中，加適量0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解并稀釋，配制成約為已知雜質(zhì)限度的50%、100%、150%的供試溶液。按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，通過外標法計算出每份樣品中各雜質(zhì)的測得量，根據(jù)測得量與加入量的比值計算每個雜質(zhì)的回收率，并計算出每個雜質(zhì)的RSD 值。試驗結果表明，雜質(zhì)Ⅰ～Ⅸ的平均回收率和RSD 分別為Ⅰ：99.6%、0.8%；Ⅱ：99.8%、1.9%；Ⅲ：99.9%、0.3%；Ⅳ：99.6%、0.7%；Ⅴ：100.2%、0.9%；Ⅵ：100.5%、0.9%；Ⅶ：99.4%、1.0%；Ⅷ：100.5%、0.4%；Ⅸ：99.2%、1.4%。均在99.0%～101.0%、均＜2.0%，表明準確度較高。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗稱取琥珀酸曲格列汀25 mg，置50 mL 量瓶中，再向其中精密量取“1.2.1”項下雜質(zhì)對照品混合儲備液5 mL，加入適量0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解并稀釋，配制成溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12 h 后，按“2.2”色譜條件進樣測定，記錄原料藥與各雜質(zhì)的峰面積。試驗表明，琥珀酸曲格列汀和雜質(zhì)Ⅰ～Ⅸ的待測溶液在室溫下12 h 內(nèi)RSD均＜2.0%，表明溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.8 耐用性試驗取本品系統(tǒng)適用性試驗溶液，分別考察在不同流速（1.0 mL·min-1±0.1 mL·min-1）和不同柱溫（35 ℃±5 ℃）的條件下，主峰和相鄰雜質(zhì)的分離度及雜質(zhì)含量的變化情況。由耐用性試驗看出，在本方法流速和柱溫發(fā)生微小變動的情況下，除保留時間略有變化外，對本品有關物質(zhì)的檢測基本無影響，系統(tǒng)適用性試驗溶液各相鄰峰之間最小分離度均＞1.5，雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ的RSD 值均＜5.0%（含量在0.5%～2.0%），雜質(zhì)ⅢRSD值＜2.0%（含量＞2.0%）。結果表明，本法測定琥珀酸曲格列汀有關物質(zhì)的耐用性良好。

2.4 有關物質(zhì)檢測

取3 批琥珀酸曲格列汀，按照“2.1.3”項下方法配制供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件進樣測定，以加校正因子的主成分對照法[5]計算各雜質(zhì)含量，見表3。

3 討論

色譜柱的選擇：琥珀酸曲格列汀化學結構中含有胺基、內(nèi)酰胺、氰基等多種含氮基團，是一種堿性化合物；另外，作為一種鹽類物質(zhì)，它具有較強的水溶性，使用常規(guī)反相色譜柱分離效果不佳，因此應選擇適合能分離堿性化合物并且耐受高比例水相的色譜柱。Welch Utimate AQ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），是一款耐100%水相的色譜柱，對于高含水量流動相具有很好的兼容性，同時該色譜柱采用雙封端技術，對于比較難分離的堿性化合物也可獲得良好的峰型，因此，最后確定選擇該色譜柱。

表3 有關物質(zhì)含量測定結果（%）

流動相的選擇：該藥pKa=8.6，在pH＞pKa+2 和pH＜pKa-2 的條件下，可以保證有良好的峰型，根據(jù)色譜柱的適用pH 范圍，選擇使用酸性體系。由于該藥在乙腈中的溶解度較高，故選擇其為有機相；在選擇水相的過程中，使用10 mmol·L-1磷酸鹽（磷酸調(diào)pH=3.0）-乙腈和10 mmol·L-1醋酸鹽（醋酸調(diào)pH=3.0）-乙腈體系時，前者會導致雜質(zhì)Ⅸ的峰型不佳，后者基線不穩(wěn)，影響檢測，而0.1%磷酸水溶液則可以確保雜質(zhì)有良好的峰型且基線平穩(wěn)。綜合考慮，最后選擇使用0.1%磷酸水溶液-乙腈體系。

檢測波長的選擇：通過二極管陣列檢測器全波長掃描結果（圖4）可知，琥珀酸曲格列汀原料藥和雜質(zhì)Ⅰ～Ⅸ在230 nm 波長附近均有較強的紫外吸收，故選擇230 nm 作為本品有關物質(zhì)的檢測波長。

強制降解實驗：本品在光照、酸性、高溫條件下相對來說較穩(wěn)定，在堿性及氧化條件下結構均不穩(wěn)定，易形成開環(huán)物，且隨反應條件加劇，雜質(zhì)增長明顯。本試驗使用系統(tǒng)適用性溶液對雜質(zhì)進行定位，可以初步確定本品在堿性條件下可產(chǎn)生雜質(zhì)Ⅰ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅸ；在氧化條件下產(chǎn)生雜質(zhì)Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ。為了能夠更好地控制琥珀酸曲格列汀的質(zhì)量，可以對降解實驗產(chǎn)生的主要雜質(zhì)進行結構確證。

綜上所述，本試驗建立了一種高效、專屬性強的琥珀酸曲格列汀有關物質(zhì)HPLC 法。該法可以有效分離主成分和已知雜質(zhì)，可用于同時測定該原料藥中9 個雜質(zhì)的含量。