邢亞茹，張麗軍，樂曉琴，陳 軍，尹 林，盧洪洲，李迎迎

1 桂林醫(yī)學(xué)院，桂林 541004；2 上海市公共衛(wèi)生臨床中心，復(fù)旦大學(xué)，上海 201508

目前，艾滋?。ˋIDS）仍然是全球主要公共衛(wèi)生問題。艾滋病患者合并感染結(jié)核（TB）的風(fēng)險(xiǎn)比未感染HIV 者高26 倍[1]。富馬酸替諾福韋酯（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）為替諾福韋（tenofovir，TFV）的口服前體藥物，是目前治療艾滋病的一線藥物，但是TFV 與腎臟損傷、特別是近端小管病變有關(guān)[2]。因此，對(duì)于艾滋合并結(jié)核的患者，測(cè)定TFV 的濃度可以協(xié)助臨床優(yōu)化個(gè)體用藥，降低藥物毒副作用，還能為抗艾滋藥物-抗結(jié)核藥物相互作用的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

目前文獻(xiàn)[3-5]報(bào)道的關(guān)于測(cè)定人血漿中TFV 濃度的方法主要有高效液相色譜法（HPLC），紫外二極管陣列高效液相色譜法（UV-DAD-HPLC），高效液相-熒光法和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）等。但是在一些方法中，樣品制備操作較繁瑣，且費(fèi)用較高[4，5]。本文建立了一種UPLC-MS 法測(cè)定人血漿中TFV 的濃度，該方法簡單、快速，且已成功用于艾滋合并結(jié)核患者血漿中TFV 濃度的檢測(cè)。

1 儀器與藥品、試劑

超高效液相色譜儀（UPLC，美國Waters 公司）；質(zhì)譜分析儀（SCIEX 5500 QTRAP，美國AB 公司）；百萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo XPE26，Mettler Toledo 公司）。

TFV 對(duì)照品（純度99.7%）、內(nèi)標(biāo)TFV-d7（純度99.6%）為TLC pharmaceutical standards 公司產(chǎn)品；甲醇為色譜純；甲酸銨為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜、質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件色譜柱：Kinetex Phenyl-Hexyl（50 mm×3.0 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相：5 mmol·L-1甲酸銨溶液（A）-甲醇溶液（B）；柱溫：40 ℃，每個(gè)樣品分析時(shí)間為3.5 min；進(jìn)樣量：10 μL。流速為：0.0～0.5 min，0.2 mL·min-1；1.0～2.0 min，0.4 mL·min-1；2.5～3.5 min，0.35 mL·min-1。

2.1.2 質(zhì)譜條件離子源：ESI（電噴霧電離源）；正離子模式掃描；噴霧電壓：5.0 kV；脫溶劑氣溫度：550 ℃；霧化氣：414 kPa；輔助加熱氣：414 kPa；氣簾氣：138 kPa；碰撞氣：中等流速（200～600 μL·min-1）。

掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），TFV 和TFV-d7 的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表1。

表1 TFV、TFV-d7 檢測(cè)的質(zhì)譜參數(shù)

在選定的質(zhì)譜條件下，TFV 和TFV-d7 的離子對(duì)分別是288.0→176.1、295.3→183.2。見圖1。

圖1 TFV（A）和TFV-d7（B）的質(zhì)譜圖

2.2 溶液的配制

精密稱取TFV 對(duì)照品2.992 mg，置于4 mL 安瓿瓶中，用10%甲醇溶解，得到1 mg·mL-1的儲(chǔ)備液。然后用50%甲醇（1∶1，v∶v）稀釋得到質(zhì)量濃度為2000、1000、400、160、50、20、10 ng·mL-1的系列對(duì)照品溶液和1600、800、160、30、10 ng·mL-1的系列質(zhì)控溶液。然后用空白血漿將對(duì)照品溶液和質(zhì)控溶液稀釋10 倍，得到對(duì)照品血漿樣品溶液和質(zhì)控血漿樣品溶液。TFV-d7 標(biāo)準(zhǔn)品同樣溶于10%甲醇中，得到濃度為1 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 血漿樣品預(yù)處理

取血漿樣品50 μL 至1.5 mL 離心管中，加入甲醇150 μL（含TFV-d7 50 ng·mL-1），混勻，4 ℃、12000 r·min-1離心10 min，取上清液50 μL 置入EP管中，用100 μL 超純水稀釋，混勻后取100 μL 加入進(jìn)樣瓶內(nèi)，進(jìn)樣10 μL。

2.4 選擇性

按照“2.3”項(xiàng)下方法處理6 份不同來源的空白血漿，且不加內(nèi)標(biāo)。觀察內(nèi)源性物質(zhì)是否干擾TFV和TFV-d7 的檢測(cè)。

進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)血漿對(duì)照品（定量下限，LLOQ）和臨床樣品，均在1.5min 附近檢測(cè)到了單一的TFV 和TFVd7 色譜峰，而空白血漿在1.5 min 時(shí)無色譜峰，因此空白血漿不影響TFV 和TFV-d7 的檢測(cè)。見圖2。

圖2 分析物及其內(nèi)標(biāo)的色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取“2.2”項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理后進(jìn)樣分析，以TFV 與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)、TFV 濃度（X）為橫坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重因子1/χ2）線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=3.65×10-2X-2.03×10-3，r=0.9983），線性范圍為1～200 ng·mL-1，LLOQ 為1 ng·mL-1。

2.6 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取空白血漿，將質(zhì)控溶液稀釋10 倍，配制濃度為160、80、16、3、1 ng·mL-1的質(zhì)控品各6 份，按照“2.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理后進(jìn)樣分析。連續(xù)測(cè)定3 個(gè)分析批。日內(nèi)準(zhǔn)確度在93.65%～103.45%，精密度（RSD）在2.42%～9.50%；日間準(zhǔn)確度在96.42%～102.35%，精密度（RSD）在4.93%～12.54%。

2.7 提取回收率試驗(yàn)

配制低、高濃度的血漿質(zhì)控樣品各6 份，按照“2.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理后進(jìn)行分析，記錄TFV 峰面積（A1）和內(nèi)標(biāo)峰面積。另取50μL 空白血漿，按照“2.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理，加入等量質(zhì)控溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，進(jìn)樣分析，記錄TFV 峰面積（A2）和內(nèi)標(biāo)峰面積。用A1與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的平均值同A2與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的平均值進(jìn)行比值計(jì)算，得TFV 低、高質(zhì)控樣品提取回收率平均值，分別為114.36%、112.96%。RSD 均＜15%。

2.8 基質(zhì)效應(yīng)

用超純水將質(zhì)控溶液稀釋10 倍，配制低、高2 個(gè)濃度的質(zhì)控品各6 份，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，記錄TFV 峰面積（A3）和內(nèi)標(biāo)峰面積。用A2與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的平均值同A3與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的平均值進(jìn)行比值計(jì)算，得TFV 低、高質(zhì)控樣品基質(zhì)效應(yīng)平均值分別為89.49%、89.60%，RSD 均＜15%。

2.9 稀釋質(zhì)控樣品考察

配制血漿濃度為400 ng·mL-1的質(zhì)控樣品，加入4 倍（稀釋因子=5）或者3 倍（稀釋因子=4）體積的空白血漿，稀釋制備成80、100ng·mL-1的2 種質(zhì)控樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，測(cè)得上述質(zhì)控樣品和血漿樣品被不同比例稀釋后的精密度，分別為5.81%和13.09%，準(zhǔn)確度分別為89.39%和100.9%。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制低、高2 個(gè)濃度的質(zhì)控樣品各6 份，進(jìn)行表2 內(nèi)5 種條件的實(shí)驗(yàn)。按照“2.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理進(jìn)樣分析，與新配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)分析。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，TFV 在不同條件下的穩(wěn)定性良好，準(zhǔn)確度在85%～115%，精密度＜15%。

表2 不同儲(chǔ)存條件下血漿中TFV 的穩(wěn)定性（n=6）

2.11 UPLC-MS 法的應(yīng)用

本研究建立的UPLC-MS 法成功用于艾滋合并結(jié)核患者血漿中TFV 濃度的測(cè)定。入組21 例艾滋合并結(jié)核患者（男性19 例），平均年齡46.56 歲（22～72 歲）。19 例用藥方案為TDF+3TC+DTG，2 例用藥方案為ETV/TDF+DTG。結(jié)核用藥有：利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、異煙肼、阿米卡星、左氧氟沙星、莫西沙星等。每例采集了不同時(shí)間點(diǎn)的2 份樣本，谷濃度和給藥后（3±1）h 各1 分。每次采集2 mL 血液至K2EDTA 抗凝管，離心后吸取50 μL 血漿用于TFV 血藥濃度檢測(cè)。該項(xiàng)目經(jīng)上海公共衛(wèi)生臨床中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：2017-Y037），所有患者均簽署了知情同意書。TFV 血藥濃度平均為108.54±87.94（2.02～413）ng·mL-1，谷濃度平均為82.26±58.29（2.02～276）ng·mL-1。其中6 份樣品超出了定量上限（200 ng·mL-1），采用稀釋后復(fù)測(cè)的結(jié)果?；颊吲R床信息與藥物濃度情況見表3。

3 討論

3.1 方法的選擇

建立的UPLC-MS 法測(cè)定人血漿中TFV 濃度，樣品采用甲醇沉淀蛋白質(zhì)法，方法簡單易操作，樣品用量少。TFV 濃度測(cè)定采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，信號(hào)強(qiáng)度高，峰形良好，提取回收率、精密度和準(zhǔn)確度均滿足《中國藥典》（2015 版）的要求。

表3 艾滋合并結(jié)核患者的臨床信息及藥物濃度

3.2 方法的應(yīng)用

本方法測(cè)得21 例艾滋合并結(jié)核患者的TFV 血藥濃度平均為（108.54±87.94）ng·mL-1。這與以往研究結(jié)果基本一致[3，6，7]，例如，Rungtivasuwan K 等[3]對(duì)150 名泰國艾滋病患者的TFV 血藥濃度進(jìn)行測(cè)定，平均濃度為（100.3±52.7）ng·mL-1；Manosuthi W 等[6]測(cè)定了117 例以替諾福韋/拉米夫定/依非韋倫治療的HIV-1 感染患者TFV 血藥濃度，其24 周后血漿TFV 平均濃度為（105±46）ng·mL-1。可能為所選人群的差異。Wiriyakosol N 等[8]測(cè)得80 例感染HIV-1泰國患者的平均血漿TFV 濃度為（78.1±46.6）ng·mL-1（12.5～229.4 ng·mL-1），中值為62.4 ng·mL-1。本研究的艾滋合并結(jié)核患者與文獻(xiàn)報(bào)道的單純艾滋感染人群的TFV 濃度基本一致[3，6，7]，未發(fā)現(xiàn)結(jié)核藥物對(duì)TFV 的明顯影響。