林 玲，吳勤研，宋熙薇

中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，南京 210002

肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，發(fā)病率、致死率居于首位，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%，大部分的NSCLC 患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳手術(shù)時期，因而化療成為其治療的主要手段之一[1-3]。近年來，相關(guān)文獻(xiàn)報道[4，5]化療藥物與中藥制劑聯(lián)合使用，具有不良反應(yīng)低、治療效果好的特點，如康艾注射液?？蛋⑸湟河牲S芪、人參和苦參素制成，具有益氣扶正、增強機體免疫、減輕化療毒副反應(yīng)、提高化療效果的作用[5]，用于治療原發(fā)性肝癌、肺癌、直腸癌和惡性淋巴癌等。以往研究者對康艾注射液的研究集中在單味藥物的藥效成分、藥理作用及化療藥物聯(lián)合使用的臨床研究上。然而康艾注射液中涉及成分較多，可能通過多靶點、多途徑發(fā)揮藥理作用，其相關(guān)作用機制研究仍不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，從整體角度探索“藥物-靶點-疾病”復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，廣泛運用于中藥復(fù)雜的作用機制研究[6，7]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)與方法，對康艾注射液多成分、多靶點間復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進行較全面系統(tǒng)地分析，為進一步深入研究其藥理作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt（http://www.uniprot.org/uploadlists/）；人類基因數(shù)據(jù)庫Genecards（http://www.genecards.org/）；蛋白質(zhì)互作平臺STRING10.5（http://www.string-db.org/）；生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID6.8（http://david-d.ncifcrf.gov/tools.jsp）。

1.2 康艾注射液中主要化學(xué)成分的收集與篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫的“search”一欄中，分別輸入黃芪、人參和苦參，收集相關(guān)的化學(xué)成分；設(shè)置閾值標(biāo)準(zhǔn)[7]（口服利用度OB＞30%、類藥性DL＞0.18），對上述化學(xué)成分進行篩選。

1.3 藥物作用靶點的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫的“target”一欄中，分別輸入化合物編號（如：MOL000392），得到該化合物的對映靶點；將靶點導(dǎo)入通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt，選擇“Human genes”，得到人的靶點基因；在人類基因數(shù)據(jù)庫Genecards 輸入“NSCLC”，得到非小細(xì)胞肺癌全部基因，與上述靶點基因進行映射，得到康艾注射液作用于非小細(xì)胞肺癌的靶點基因。

1.4 康艾注射液的化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將化合物與其對映的靶點基因在Excel 表中列出，化合物名稱設(shè)置為“#node1”，靶點基因欄設(shè)置為“node2”。將Excel 表導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 軟件，得到化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)關(guān)系圖；用Cytoscape 3.7.0軟件中“Network analyzer”功能，對網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩赃M行分析，得到康艾注射液抗非小細(xì)胞肺癌的主要活性成分。

1.5 康艾注射液蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述1.3 得到的靶點基因上傳到STRING 10.5 軟件（http://www.string-db.org/），設(shè)置物種為“Homo sapiens”，進行檢索，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖；用STRING 10.5 軟件對PPI 網(wǎng)絡(luò)圖進行分析，得到相關(guān)靶點參數(shù)。

1.6 康艾注射液相關(guān)靶點基因本體GO 富集分析和京都基因百科全書（KEGG）生物通路富集分析

將PPI 網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)靶點導(dǎo)入生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID6.8（http://david-d.ncifcrf.gov/tools.jsp），對PPI 網(wǎng)絡(luò)中涉及蛋白靶點進行GO 功能和KEGG 通路生物富集分析。

2 結(jié)果

2.1 康艾注射液中活性化合物的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫里，檢索黃芪，共得到87 個化合物，篩選出8 個符合條件化合物；檢索人參，共得到190 個化合物，篩選出8 個符合條件化合物；檢索苦參，共得到113 個化合物，篩選出5 個化合物。上述篩選閾值[7]分別是OB＞30%、DL＞0.18。OB值代表口服利用度，藥物經(jīng)過口服途徑給藥后吸收進入血液循環(huán)的相對量；DL 代表類藥性，化合物與已知藥物的相似性，用于發(fā)掘高質(zhì)量的先導(dǎo)化合物。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8]引入槐醇（sophranol）和槐胺（sophoramine）兩個化合物。康艾注射液中含有的23個活性化合物基本信息。見表1。

2.2 康艾注射液化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用23 個化合物與其對映的靶點的關(guān)系，構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖1。在化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中，總共包括123 個節(jié)點（23 個化合物節(jié)點和100個靶點節(jié)點）和383 條邊。對網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩赃M行分析，得出相應(yīng)的節(jié)點度值（degree）和介數(shù)參數(shù)（betweenness centrality）。度值表示網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點連接的路線條數(shù)，度值越大，表示該節(jié)點在整個網(wǎng)絡(luò)中起到重要樞紐作用，可能是主要活性成分或靶點；介數(shù)則表示該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中所有最短路徑中經(jīng)過該節(jié)點的路徑條數(shù)與最近路徑總數(shù)比。度值和介數(shù)是量化某個節(jié)點在拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中的重要性[6，7，9，10]。

表1 康艾注射液中含有23 個活性化合物基本信息

圖1 康艾注射液化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)

表2 列出了化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中化合物和靶點的度值和介數(shù)（篩選設(shè)置Degree＞4[6]）。

從表2 中看出，在康艾注射液多成分中，起主要作用的化合物有MOL000422（山奈酚），MOL000354（異鼠李素），MOL000358（β-谷甾醇），MOL000449（豆甾醇），MOL006634（氧化苦參堿）和MOL005944（苦參堿）等；作用靶點有PTGS2、PTGS1、SCN5A、PRKACA 和HSP90A 等。

表2 康艾注射液化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點及其拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)

2.3 康艾注射液靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）是反映蛋白之間相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)，能分析出一系列生物分子相互作用有關(guān)的重要靶蛋白。為了更好地理解康艾注射液對非小細(xì)胞肺癌的作用機制，基于PPI 關(guān)系，采用STRING 10.5 軟件構(gòu)建康艾注射液靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)。分析PPI 網(wǎng)絡(luò)，得到93 個蛋白質(zhì)節(jié)點（其中有7 個節(jié)點未顯示），597 條相互作用的邊（PPI enrichment p-value：＜1.0×10-16）。

為了提供更精確的結(jié)果，用STRING 10.5 軟件分析該網(wǎng)絡(luò)（見上述材料方法1.5），得到主要相關(guān)靶點（涉及蛋白IL6、TNF、JUN、MYC、CASP3、MAPK8、PTGS2 等），用Origin8.0 軟件作圖，見圖2。

將上述蛋白靶點導(dǎo)入STRING 10.5 軟件，得到篩選后的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖3。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)中的重要靶點（篩選后）

圖3 康艾注射液相關(guān)靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)（篩選后）

2.4 康艾注射液GO 富集與KEGG 通路富集分析

采用DAVID6.8 平臺上的GO 和PATHWAY 富集分析功能，對康艾注射液PPI 網(wǎng)絡(luò)中涉及93 個蛋白質(zhì)功能進行分析。對GO 進行富集分析，得到43個條目[設(shè)置錯誤發(fā)生率（FDR＜0.01）作為篩選條件，見表3]，其中生物過程相關(guān)的條目有32 個，涉及氧化反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)刺激反應(yīng)、對有毒物質(zhì)反應(yīng)、內(nèi)源刺激反應(yīng)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、激素應(yīng)答和細(xì)胞增殖的調(diào)控等方面；分子功能相關(guān)的條目6 個，涉及蛋白結(jié)合、酶結(jié)合位點、乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性和G蛋白偶聯(lián)胺受體活性等方面；細(xì)胞組成相關(guān)的條目5 個，涉及膜筏、質(zhì)膜區(qū)域和投射神經(jīng)元等方面。

對KEGG 通路富集分析中，得到50 個信號通路，根據(jù)FDR 篩選出5 條通路（見表4），分別為癌癥通路、白介素-17 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、雌激素受體信號傳導(dǎo)通路和NF-kappa B 信號通路，推測康艾注射液的有效成分可以作用于這些通路來達(dá)到抗NSCLC 的作用。在本研究中，癌癥通路上有27 個基因富集，分別為BAX、BCL2、CASP3、ESR1、ESR2、GSK3B、GSTM1、GSTM2、GSTP1、HMOX1、HSP90AA1、IFNG、IL6、JUN、MAPK8、MMP1、MMP2、MYC、NCOA1、NFKBIA、NOS2、PIM1、PPARG、PRKACA、PTGS2、RELA、RXRA；有14 個基因富集在白介素-17 通路上，分別為CASP3、GSK3B、HSP90AA1、IFNG、IL1B、IL6、JUN、MAPK14、MAPK8、MMP1、NFKBIA、PTGS2、RELA、TNF；有13 個基因富集在腫瘤壞死因子通路上，分別為CASP3、ICAM1、IL1B、IL6、JUN、MAP2K4、MAPK14、MAPK8、NFKBIA、PTGS2、RELA、TNF、VCAM1；有11 個基因富集在雌激素受體通路上，分別為BCL2、ESR1、ESR2、HSP90AA1、JUN、MMP2、NCOA1、NCOA2、OPRM1、PGR、PRKACA；有9 個基因富集在NF-kappa B 信號通路上，分別是BCL2、ICAM1、IL1B、NFK BIA、PLAU、PTGS2、RELA、TNF、VCAM1。

表3 康艾注射液PPI 網(wǎng)絡(luò)中的GO 條目（FDR＜0.01）

表4 康艾注射液PPI 網(wǎng)絡(luò)中的通路（FDR＜0.01）

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對復(fù)雜生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，擇取特定信號節(jié)點（Nodes）進行多靶點藥物分子設(shè)計的新興學(xué)科；根據(jù)其具有整體性和系統(tǒng)性的特點，用于挖掘復(fù)方中藥制劑的藥效成分、作用靶點及預(yù)測適應(yīng)癥[6]?？蛋⑸湟菏墙?jīng)由人參、黃芪和苦參素3 味中藥制備而成的一種抗癌藥，臨床上與化療藥物（如順鉑）聯(lián)合治療非小細(xì)胞肺癌效果顯著[11]。本研究依托TCMSP 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺研究了康艾注射液中3 味中藥的有效成分，同時構(gòu)建了化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作PPI 網(wǎng)絡(luò)，利用DAVID6.8 平臺對PPI 網(wǎng)絡(luò)中涉及的蛋白質(zhì)進行GO 富集和KEGG 信號通路富集。

化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中涉及的關(guān)鍵的化合物有山奈酚、β-谷甾醇、氧化苦參堿和苦參堿等。山奈酚是廣泛存在于中藥材、水果和蔬菜中的黃酮類化合物，具有抗癌、抗炎、抗動脈粥樣硬化，保護神經(jīng)系統(tǒng)和防治糖尿病等藥理作用[12]。山奈酚具有良好的抗癌生物活性，對白血病、肺癌[13]、結(jié)腸癌[14]和肝癌[15]等多種癌癥有顯著療效。β-谷甾醇是植物甾醇的一類，存在于蔬菜、茶葉、中藥材和水果中，具有抑制腫瘤生長、防治前列腺增生、抑制乳腺增生和免疫調(diào)控等生物活性[16]。周玲玉等[17]研究β-谷甾醇對人肺癌A549 細(xì)胞增殖及凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇通過抑制肺癌A549 細(xì)胞周期中的G2/M 期，促使癌細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤的目的。氧化苦參堿通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化、抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞黏度與浸潤轉(zhuǎn)移和抑制端粒細(xì)胞的活性等過程達(dá)到抗癌、防癌的作用[18]。上述篩選的化合物中，現(xiàn)有文獻(xiàn)報道較多的是氧化苦參堿[18]與康艾注射液臨床研究一致，而山奈酚、β-谷甾醇、異鼠李素和芒柄花素等研究較少，隨著研究不斷深入，越來越多的抗癌活性成分被逐漸挖掘出來。

化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中涉及重要靶點有PTGS2、PRKACA、HSP90A 等。PTGS2 又稱環(huán)氧化酶-2，是PEG2 合成的重要限速酶，在炎癥或腫瘤形成過程中表達(dá)上調(diào)[19]。熱休克蛋白（heat shock protein 90α，Hsp90α）廣泛存在于生物細(xì)胞中，具有維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用，隨著腫瘤惡性程度增高，Hsp90α 表達(dá)水平隨之升高[20]。張茂川等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90α非小細(xì)胞肺癌患者血漿中的表達(dá)顯著高于健康體檢者，提出Hsp90α 可作為非小細(xì)胞肺癌輔助診斷的腫瘤標(biāo)志物。蛋白互作PPI 網(wǎng)絡(luò)中涉及關(guān)鍵蛋白有IL-6、TNF、JUN、MYC[l12]和PTGS2 等。TNF 即腫瘤壞死因子，是機體重要的細(xì)胞因子，調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞免疫的功能。符一寧等[22]研究發(fā)現(xiàn)，吉西他濱聯(lián)合順鉑能改構(gòu)人腫瘤壞死因子，治療非小細(xì)胞肺癌，還可以降低患者抑制因子、胸苷激酶-1 表達(dá)水平。白介素-6（IL-6）是由T 細(xì)胞與成纖維細(xì)胞活化后產(chǎn)生的淋巴因子，參與炎癥反應(yīng)。JUN 是原活化的蛋白激酶（MAPK）信號通路的成員之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等生理活動。有文獻(xiàn)報道[11]，在康艾注射液治療非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，觀察指標(biāo)有血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、TNF-α 和IL-10 等。本研究挖掘出PTGS2、Hsp90α、IL-6、JUN 和MYC 等，經(jīng)證實這些蛋白在腫瘤細(xì)胞形成、生長、凋亡中起到重要作用。本研究挖掘的化合物（如山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇等）具有抗癌生物活性，作用于上述蛋白靶點鮮有報道。

對GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn)，康艾注射液治療非小細(xì)胞肺癌的基因功能主要體現(xiàn)在細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞氧化反應(yīng)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和內(nèi)源刺激反應(yīng)等方面。KEGG 通路涉及癌癥通路、白介素-17 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、雌激素受體信號傳導(dǎo)通路和NF-kappa B 信號通路，推測康艾注射液的有效成分可以作用于這些通路來達(dá)到抗NSCLC。NF-kappa B 又稱核轉(zhuǎn)錄因子-κB，具有多種生理功能的轉(zhuǎn)錄因子，該通路參與調(diào)控多種惡性腫瘤的形成[23]。NF-κB 能增加抗凋亡基因Bcl-2 的表達(dá)，減少變異細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致肺癌的發(fā)生[24]。此外，NF-κB可以上調(diào)CDK1、CDK2、cyclinA、cyclinB 和P-CDC2等，促使肺癌細(xì)胞G1/S、G2/M 期過渡，加快肺癌細(xì)胞的增殖[25]。路顏增等[11]研究康艾注射液輔助化療藥物治療晚期肺癌，發(fā)現(xiàn)該藥能顯著降低TNF-α 表達(dá)水平，有效緩解晚期肺癌患者的炎癥狀態(tài)，減輕毒副反應(yīng)，提高機體免疫力。康艾注射液對白介素-17信號通路和雌激素受體信號通路研究較少，是否通過上述通路來抑制NSCLC 需要深入研究。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)與方法，篩選出的化合物藥理作用、作用靶點、信號通路與現(xiàn)有康艾注射液研究報道基本一致，相比而言，初步闡釋了康艾注射液發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，為進一步深入研究奠定基礎(chǔ)。此外，挖掘出康艾注射液能通過多個靶點、多條信號通路抗非小細(xì)胞肺癌，為進一步研究化療藥物輔助用藥提供參考依據(jù)。