賀宗毅 ，李 卿 ，張德利 ，羅昌樹 ，陳仕江 **

（1.重慶市中藥研究院，重慶400065；2.重慶市中藥資源學重點實驗室，重慶400065；3.中國中醫(yī)科學院，中藥資源中心重慶分中心，重慶400065）

金針菇 （Flammulina filiformis） 是著名的食（藥）用菌，又稱冬菇、樸菇、構菌等，隸屬于擔子菌門 （Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 傘菌目（Agaricales） 膨瑚菌科（Physalacriaceae） 小火焰菌屬（Flammulina）[1]。黃金針菇是我國食用菌產(chǎn)業(yè)技術最成熟的品種之一，根據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，金針菇年產(chǎn)量在香菇（Lentinula edodes）、側耳屬（Pleurotus）、黑木耳 （Auricularia auricula） 之后，位居第四位，年總產(chǎn)量達260萬噸左右[2]。其子實體含有的多糖、蛋白質(zhì)、萜類化合物和構菌素等活性代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗過敏、改善記憶障礙、抗氧化以及保肝護肝等多種生物活性[3-8]。

黃色金針菇菇味濃郁，口感較白色金針菇脆嫩爽滑，深受廣大消費者青睞。因金針菇具有溫度適應性廣，栽培、管護簡單，投資小、見效快等特點，可作為貧困地區(qū)農(nóng)戶脫貧增收項目[9-11]。近年來，隨著黃金針菇推廣范圍及面積的擴大，有望成為貧困山區(qū)脫貧的主導產(chǎn)業(yè)。目前，重慶有18個深度貧困鄉(xiāng)鎮(zhèn)，均分布于重慶渝東南和渝東北山區(qū)，這些山區(qū)生態(tài)環(huán)境良好，海拔1 000 m以上，年平均氣溫16℃～18℃，非常適宜食用菌的生長[10]。但山區(qū)農(nóng)戶栽培黃金針菇存在規(guī)模小、分散程度高、集約化程度低等缺點，傳統(tǒng)固體菌種和液體菌種均不適合在山區(qū)推廣，而安全、穩(wěn)定的菌種供應成為貧困山區(qū)農(nóng)戶栽培黃金針菇的攔路虎。因此研制易運輸、易儲藏、活力強的小單位生產(chǎn)用菌種制劑是解決上述問題的關鍵。目前國內(nèi)外尚未見黃金針菇菌種制劑的研發(fā)報道。因外，研發(fā)黃金針菌種制劑及采用的供應模式為山區(qū)農(nóng)戶栽培其他食（藥）用菌及產(chǎn)業(yè)扶貧提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株：黃金針菇（Flammulina filiformis） 菌種，保存于重慶市中藥研究院；溶劑油：聚乙二醇、鄰苯二甲酸二丁酯，均為分析純試劑；分散劑：十二烷基硫酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈉，均為分析純試劑；表面活性劑：吐溫-80、脂肪醇聚氧乙烯醚、司盤-80、聚氧乙烯辛基苯酚醚-10，均為分析純試劑；助懸劑：硬脂酸鋁、二氧化硅、海藻酸鈉、羧甲基纖維素，均為分析純試劑。以上試劑均購于重慶鉑鍶鈦科技有限公司。

儀器設備：UV-1750島津紫外可見分光光度計，島津（中國）有限公司；TDL-40B高速離心機，上海安亭科學儀器廠；SW-CJ-1D凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；GZX-9070數(shù)顯鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司設備廠；電冰箱，合肥榮事達電冰箱有限公司；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；AUY120分析天平，島津國際貿(mào)易公司；高壓滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃金針菇液體菌種的制備

1）黃金針菇液體菌種的培養(yǎng)

液體種子基礎培養(yǎng)基為：葡萄糖15 g、酵母粉5 g、硫酸鎂 0.5 g、磷酸二氫鉀 0.5 g、磷酸氫二鉀0.5 g，水 1 000 mL。

將培養(yǎng)好的斜面菌種切取蠶豆大小，接于液體培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝液量100 mL，溫度25℃，150 r·min-1，搖床培養(yǎng) 3 d。

2）黃金針菇發(fā)酵菌絲體的制備

取發(fā)酵好的液體菌種，在超凈工作臺中用已滅菌的濾紙將發(fā)酵液過濾，得黃金針菇菌絲體，將獲得的菌絲體轉至無菌培養(yǎng)皿中，備用。

1.2.2 黃金針菇混懸菌種制劑的配制

取具塞且無菌的刻度試劑管（60 mL），于每支試管中加入已制備好的黃金針菇菌絲體（約5 g）和50 mL溶劑油（聚乙二醇和鄰苯二甲酸二丁酯），再分別加入分散劑、表面活性劑和助懸劑，充分混勻，靜置24 h，測定其沉降體積比。固液比的優(yōu)化試驗按此法配制即黃金針菇菌絲體（固體）稱取m1（g），液體為試驗中使用的溶劑油V1（mL），在后續(xù)試驗中固液比 （體系） 表述為 m1∶V1（g∶mL）。

1.2.3 沉降體積比的測定

沉降體積比的測定：將上述制備好的各混懸劑置于刻度試管內(nèi)，靜置24 h后，分別測定其沉降體積比（S），公式為：

式中：H1為沉降后混懸液的高度（mm）；H0為沉降前混懸液的高度（mm）。

1.2.4 優(yōu)化后的黃金針菇菌種制劑的配制

取具塞且無菌的刻度試劑管（60 mL），于每支試管中加入已制備好的黃金針菇發(fā)酵菌絲體30 g、聚乙二醇35 mL、鄰苯二甲酸二丁酯15 mL，再分別加入十二烷基硫酸鈉0.7 g，聚氧乙烯辛基苯酚醚-10約0.4 g，羧甲基纖維素0.6 g，充分混勻即得1個單位黃金針菇菌種制劑。

1.2.5 黃金針菇接種出菇試驗

栽培方式為袋式熟料栽培，栽培菌袋規(guī)格17 cm ×33 cm×0.03 cm。

1） 菌袋制作

栽培配方為酒糟64%、棉籽殼15%、玉米芯15%、麥麩5%、石灰1%。按以上配方計算出具體的用量，稱取新鮮、無霉變、無蟲蛀、干凈、干燥的原料。將稱好的棉籽殼、玉米芯用水發(fā)透后。再將其他原料混入其中拌勻。栽培料的水分含量控制在65%～70%，以用手握一把料，指縫間有水滴滲出，但不滴下為宜。以石灰水調(diào)節(jié)pH至6.5左右，裝料時松緊適宜，每袋裝料約500 g。

將裝好的菌袋分層碼在滅菌灶內(nèi)，袋與袋之間留2 cm的空隙，以便蒸汽流通，滅菌徹底。接好通氣管后用高壓滅菌方法滅菌6 h。

2）接種

當菌袋冷卻至30℃時，將料袋和經(jīng)75%酒精表面消毒的液體種瓶和清洗干凈的接種工具，放入接種箱內(nèi)，用優(yōu)氯凈消毒粉熏蒸0.5 h即可接種。將1.2.4中1） 所述制得的菌種制劑接種于栽培袋內(nèi)，每袋栽培袋用2個單位菌劑。接種過程應盡可能縮短開袋時間，做到無菌操作，嚴格控制，減少污染。待接種完成后將菌包轉移到已消毒的發(fā)菌室。

3） 發(fā)菌管理

把菌袋分層碼在發(fā)菌室內(nèi)，堆碼高度為6層。袋與袋之間應留有適當空隙，以利于氣體交換。發(fā)菌期溫度控制在22℃～24℃為宜，空氣濕度控制在70%以下。發(fā)菌期間結合溫度、濕度情況進行通風換氣，保持空氣新鮮。待菌絲生長至過肩之后，可進行翻堆，將外緣的菌袋向內(nèi)移動，里層的菌袋向外移動，以便菌絲的長勢相對一致。同時剔出生長狀態(tài)不良和被污染的菌袋。

4）出菇期管理

菌絲長滿菌袋后便可搔菌，搔菌后，遂轉至催蕾室繼續(xù)培養(yǎng)，待菌包現(xiàn)原基后移至出菇房培養(yǎng)即可出菇。出菇期環(huán)境溫度控制在溫度6℃、濕度80%，每天打開通風口通風換氣，保持空氣新鮮。出菇階段，保持栽培室內(nèi)不要有強光照射，保證一定的散射光。光照強度控制在500 lx～2 000 lx。

5）采收

菌蓋淺黃色至黃褐色，菌柄黃褐色；菌蓋圓整，呈半球形，菌柄挺直；菌蓋直徑小于3 cm；菌柄長15 cm即可采收，稱重，統(tǒng)計分析。

1.2.6 正交試驗設計

根據(jù)單因素中4個因素的試驗結果，取各因素的最優(yōu)值作為中間水平進行L9（34）正交試驗。各因素選取水平情況見表1。

表1 正交試驗因素水平Tab.1 The factor level of orthogonal experiment

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

每次試驗所得數(shù)據(jù)均采取3次生物學重復后計算而來，采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)的均值和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 溶劑油復配比例對菌劑質(zhì)量的影響

影響混懸制劑質(zhì)量的指標主要有分散性、流動性、沉降體積比、穩(wěn)定性等[11]，其中《中國藥典》2015版對混懸制劑質(zhì)量的考察要求是沉降體積比，口服混懸劑的沉降體積比應不低于0.90[12]。各溶劑油的理化性質(zhì)不同，其復配比例直接影響混懸菌劑的沉降體積比，進而影響菌劑的質(zhì)量[13]。

對已篩選出的溶劑油聚乙二醇和鄰苯二甲酸二丁酯進行配比研究，通過測定，聚乙二醇∶鄰苯二甲酸二丁酯 （mL ∶mL） 為 0∶10、3∶7、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0 時，沉降體積比分別為 36%、48%、57%、68%、79%、70%、58%、40%。隨著聚乙二醇含量的增加及鄰苯二甲酸二丁酯含量逐漸減少，黃金針菇菌劑的沉降體積比呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。為獲得菌劑較優(yōu)的沉降體積比，選定聚乙二醇∶鄰苯二甲酸二丁酯為7∶3作為復合油溶劑。

2.2 黃金針菇菌劑固液比對菌劑質(zhì)量的影響

在菌劑的體系中，固液比的不同影響菌體在體系中的分散程度，從而影響菌劑沉降體積比[14]。

通過測定，固液比為 5∶50、10∶50、15∶50、20∶50、25∶50、30∶50時，沉降體積比分別為38%、46%、57%、83%、90%、82%。隨著固液比的增加，沉降體積比呈現(xiàn)增高的趨勢；若固液比繼續(xù)增大，由于菌絲體自身的重力及團聚現(xiàn)象，菌絲體將無法分散在溶劑油中，此時沉降體積比反而降低。因此，選擇固液比為25∶50為佳。

2.3 助劑添加對菌劑質(zhì)量的影響

目前，在生防菌劑研發(fā)領域，使用較多的助劑主要是分散劑、表面活性劑和助懸劑。分散劑的主要作用是防止菌體發(fā)生團聚現(xiàn)象，促進菌體均勻地分散在溶劑油體系中[15]；表面活性劑能顯著降低溶液的表面張力或界面張力，并能改進溶液的增溶、乳化、分散、滲透、潤濕等能力[16]；助懸劑主要是增加混懸劑中分散介質(zhì)的粘度，從而降低微粒的沉降速度[17]。因此，為了進一步提高菌劑的質(zhì)量，在上述優(yōu)化試驗的基礎上，分別對分散劑種類（1個單位菌種制劑加入0.4 g）、表面活性劑種類（1個單位菌種制劑加入0.5 g） 和助懸劑種類（1個單位菌種制劑加入0.4 g）的添加進行考察，以清水為對照組，結果見表2。

表2 助劑添加種類對菌劑質(zhì)量的影響Tab.2 Effect of kinds of auxiliaries on the quality of strain agent

從表2可知，不同的助劑添加對菌劑沉降體積比的影響不同，較好的分散劑是十二烷基硫酸鈉，表面活性劑是聚氧乙烯辛基苯酚醚-10，助懸劑是羧甲基纖維素。

2.4 不同助劑濃度對菌劑質(zhì)量的影響

在確定助劑種類的情況下，不同助劑添加量對菌劑質(zhì)量的影響見表3。

表3 不同助劑濃度對菌劑質(zhì)量的影響Tab.3 Effects of different concentrations of auxiliaries on the quality of strain agents

由表3可知，隨著分散劑添加量的增加，沉降體積比呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢；隨著表面活性劑的用量增大，沉降體積比呈現(xiàn)先增加后趨穩(wěn)；隨著助懸劑的加入，沉降體積比亦呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。因此，分別選擇十二烷基硫酸鈉用量為0.7 g，聚氧乙烯辛基苯酚醚-10用量為0.7 g，羧甲基纖維素用量為0.6 g用于后續(xù)試驗。

2.5 正交試驗結果

根據(jù)上述單因素試驗結果，對固液比、十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯辛基苯酚醚-10及羧甲基纖維素4個因素進行正交試驗優(yōu)化。正交試驗結果及分析見表4。

表4 正交試驗設計及結果分析Tab.4 The orthogonal experiment design and results

由表4可知，表面活性劑聚氧乙烯辛基苯酚醚-10是影響黃金針菇菌劑分散及沉降體積比的最顯著因素，其余3個因素的顯著性影響程度依次是羧甲基纖維素＞固液比＞十二烷基硫酸鈉。4個試驗因素的最佳培養(yǎng)組合為：A3B2C1D2，即固液比為30∶50，十二烷基硫酸鈉添加量為0.7 g，聚氧乙烯辛基苯酚醚-10添加量為0.4 g，羧甲基纖維素添加量為0.6 g。按優(yōu)化后的條件制備黃金針菇菌種制劑并接種于出菇用菌包內(nèi)，各組的鮮菇產(chǎn)量統(tǒng)計見表5。

由表5可知，接種黃金針混懸菌種制劑的菌包平均產(chǎn)量為545.33 g，對照組平均產(chǎn)量為541.67 g。經(jīng)統(tǒng)計分析表明兩者無顯著差異（P＞0.05），表明本試驗研制的黃金針菇混懸菌種制劑產(chǎn)菇效果與工廠化的相當，可用于生產(chǎn)實踐。

表5 不同菌劑出菇對比試驗Tab.5 Comparative experiment on mushroom emergence with different microbial inoculum

3 討論

目前，微生物菌劑主要是將真菌的菌絲體或孢子配制成水懸液、粉劑等劑型[14-18]，應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。在植物病蟲害防治方面，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、蘇云金芽胞桿菌 （Bacillus thuringiensis）等制劑主要用于對松毛蟲、青蟲等害蟲的防控[23]；木霉菌（Trichoderma spp.）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis） 等生防菌劑用于對植物病害的防治[24-25]。在食用菌生產(chǎn)種的制備領域，主要采用固體菌種或液體菌種用于生產(chǎn)菌包的接種，食用菌固體菌種便于運輸，污染率低，菌棒或菌袋被污染后可迅速清理，不會導致多規(guī)模的污染，受到廣大菇農(nóng)的青睞，但需要投入較多的人力和設備[26]。食用菌液體菌種具有菌絲菌齡較一致、生長速度快、純度高、活力強、成本較低的特點[27]，但液體菌劑在制作過程中對設備的要求較高，液體菌種的獲得需要發(fā)酵系統(tǒng)、滅菌系統(tǒng)、空氣壓縮機、空氣凈化系統(tǒng)等，對設備運行、維護的要求較高。

重慶18個貧困鄉(xiāng)鎮(zhèn)所分布的地區(qū)以山地丘陵為主，氣候適宜食用菌的生長，但基礎設施建設落后，產(chǎn)業(yè)基礎薄弱，造成該區(qū)域內(nèi)長期以來面臨產(chǎn)業(yè)空心化等問題。因食用菌具有不爭農(nóng)時、不爭肥、占地少、周期短、投資小、見效快等特點，已成為各貧困地區(qū)脫貧的主導產(chǎn)業(yè)，為解決貧困山區(qū)黃金針菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展中生產(chǎn)用菌種的供應問題，在掌握黃金針菇菌絲體的生物學特性和栽培特性的基礎上，通過正交試驗，確定了制備黃金針菇混懸菌種制劑的最優(yōu)培養(yǎng)條件：固液比為30∶50，十二烷基硫酸鈉添加量為0.7 g，聚氧乙烯辛基苯酚醚-10添加量為0.4 g，羧甲基纖維素添加量為0.6 g。經(jīng)檢測混懸制劑沉降體積比為95%，達到2015版《中國藥典》對混懸制劑的檢測要求，制備的混懸菌種制劑菌絲體分散均勻、穩(wěn)定性好、不易沉降。此外，采用混懸菌種制劑接種的菌包黃金針菇平均產(chǎn)量為545.33 g，與接種液體菌種培養(yǎng)的黃金針菇產(chǎn)量（541.67 g）相當，表明該混懸菌種制劑可運用于山區(qū)分散式扶貧產(chǎn)業(yè)的推廣，可有效解決貧困山區(qū)農(nóng)戶菌劑來源的問題，為食（藥）用菌新型菌種制劑的研制及扶貧產(chǎn)業(yè)模式的推廣提供了借鑒。