侯小濤，韋棪婷，夏中尚，韋 瑋，郝二偉，杜正彩，周月敏，鄧家剛*

基于血清藥物化學(xué)的厚藤治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎質(zhì)量標(biāo)志物研究

侯小濤1, 2，韋棪婷1, 2，夏中尚2, 3，韋 瑋2，郝二偉2，杜正彩2，周月敏1，鄧家剛2*

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200 3. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137

基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）的概念，研究厚藤提取物對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis，AGA）大鼠的治療作用，并分析厚藤提取物在正常大鼠及AGA大鼠的血中移行成分，為厚藤Q(mào)-Marker的確定提供依據(jù)。采用尿酸鈉建立AGA大鼠模型，考察厚藤提取物對(duì)AGA大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、足墊腫脹程度和滑膜組織病理變化的影響，考察厚藤提取物對(duì)AGA大鼠血清中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）和MIP-2水平的影響。采用液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（LC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)對(duì)厚藤提取物進(jìn)行定性分析，探尋正常大鼠和AGA大鼠ig厚藤提取物后的入血成分。與模型組比較，厚藤提取物組大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)和足墊厚度均顯著降低（＜0.05、0.01），厚藤提取物高、中劑量組大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平均顯著降低（＜0.05），厚藤提取物高、中劑量組大鼠滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。從厚藤提取物中鑒定出樹脂糖苷類、黃酮類、有機(jī)酸類、香豆素類、核苷類、木脂素類等53個(gè)成分，其中有機(jī)酸類和黃酮類為其主要成分，并推測(cè)了樹脂糖苷類、黃酮類、有機(jī)酸類、香豆素類部分成分的裂解規(guī)律；正常大鼠含藥血漿中鑒定出蘋果酸、咖啡酸、咖啡酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸4個(gè)成分，AGA大鼠含藥血漿中鑒定出莨菪亭、咖啡酸、咖啡酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸4個(gè)成分。厚藤提取物能夠明顯改善AGA大鼠關(guān)節(jié)腫脹，抑制血清中IL-1β、MIP-1α及MIP-2水平，并抑制炎癥反應(yīng)；采用LC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)可快速鑒定厚藤水提物的主要成分為有機(jī)酸類和黃酮類，莨菪亭、咖啡酸、綠原酸及其異構(gòu)體（新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C）和原兒茶酸在AGA大鼠中以原型成分或代謝物形式入血，可作為厚藤治療AGA的Q-Marker。

厚藤；急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；質(zhì)量標(biāo)志物；液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜；莨菪亭；咖啡酸；綠原酸；新綠原酸；隱綠原酸；異綠原酸B；異綠原酸A；異綠原酸C；原兒茶酸

痛風(fēng)是嘌呤代謝紊亂造成皮下組織、關(guān)節(jié)周圍、骨骼及尿路中尿酸鹽結(jié)晶沉淀而引發(fā)的病變，我國(guó)痛風(fēng)發(fā)病率1%～3%，為僅次于糖尿病的第2大代謝類疾病[1-2]。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis，AGA）是痛風(fēng)急性發(fā)作期的首發(fā)癥狀，其發(fā)病機(jī)制與炎癥反應(yīng)和高尿酸血癥密切相關(guān)[3]。目前臨床上針對(duì)AGA的化學(xué)藥物多為秋水仙堿、非甾體類抗炎藥物、糖皮質(zhì)激素等[4]，普遍存在不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用上受到一定的限制。目前越來越多的研究從中西醫(yī)結(jié)合的途徑入手，探索中醫(yī)藥在治療AGA的優(yōu)勢(shì)。

厚藤(Linn.) Sweet為旋花科番薯屬植物，是我國(guó)南方沿海地區(qū)常用的海洋中藥，其味辛、苦，性微寒，歸肺、肝、胃、大腸經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、消癰散結(jié)、拔毒消腫的功效，常用于治療腰肌勞損、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等疾病[5-6]。厚藤具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[7]?？寡谆钚耘c厚藤祛濕拔毒等傳統(tǒng)功效密切相關(guān)，被認(rèn)為是其主要的藥效作用。目前其抗炎活性研究多停留在驗(yàn)證傳統(tǒng)功效層面，未見對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究的報(bào)道，也未見對(duì)其化學(xué)成分與藥理作用之間關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究的報(bào)道?；趧⒉⒃菏縖8]提出質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）的概念，本研究利用液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（LC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)，在藥物有效的前提下，分別對(duì)正常大鼠和AGA大鼠ig厚藤提取物后的含藥血漿進(jìn)行分析，為厚藤Q(mào)-Marker的確定及其藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)和思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、濕度50%～60%、12 h/12 h晝夜交替光照的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)DW20190418-015）。

1.2 藥材

厚藤于2019年4月20日采自廣西防城港市北侖河口國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為旋花科植物厚藤(L.) Sweet。

1.3 藥品與試劑

尿酸鈉（批號(hào)U2875-5G）購自美國(guó)Sigma公司；秋水仙堿片（批號(hào)180101）購自西雙版納版納藥業(yè)公司；4%多聚甲醛（批號(hào)70120900）購自Biosharp公司；EDTA脫鈣液（批號(hào)E1171）購自北京索萊寶科技有限公司；白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）、MIP-2多因子試劑盒（批號(hào)64325505）購自美國(guó)BIO-RAD公司；質(zhì)譜級(jí)甲醇、乙腈購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；色譜級(jí)甲酸購自日本TCI公司；異槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)DST180108-006）購自德思特生物公司；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)AF8112791）購自成都埃法生物科技公司；異莨菪亭對(duì)照品（批號(hào)PS020323）購自成都普思生物科技公司）；阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)MUST-18032928）購自成都曼思特生物公司；對(duì)照品秦皮乙素（批號(hào)190329）、異綠原酸C（批號(hào)190507）、異綠原酸A（批號(hào)190423）、異綠原酸B（批號(hào)160822）、咖啡酸（批號(hào)160803）購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；以上對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。

1.4 儀器

ExionLC AC液相色譜儀、X500R QTOF質(zhì)譜儀、SCIEX OS 2.0數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)SCIEX公司）；CPA225D萬分之一天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器北京公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器公司）；Hei-VAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph公司）；TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；X-200 Luminex多功能流式點(diǎn)陣儀（美國(guó)Luminex公司）。

2 方法

2.1 厚藤提取物的制備

稱取厚藤地上部分粗段，加入12倍量水煮沸后再煎30 min，濾過；再加入10倍量水提取1次，合并2次濾液，55 ℃減壓濃縮至稠膏。

2.2 動(dòng)物分組、造模與給藥

大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、秋水仙堿（0.27 mg/kg）組和厚藤提取物高、中、低劑量（928.80、464.40、222.90 mg/kg，分別相當(dāng)于成人每日服用生藥材50、25、12 g）組，每組10只，另隨機(jī)選取3只作為正常給藥組。各給藥組ig相應(yīng)藥物，正常給藥組ig厚藤提取物（928.80 mg/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積純化水，1次/d，連續(xù)7 d。第7天給藥1 h后，大鼠ip 10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，正常給藥組和對(duì)照組大鼠于右后側(cè)踝關(guān)節(jié)腔注射0.1 mL無菌生理鹽水，其余各組大鼠于右后側(cè)踝關(guān)節(jié)腔注射0.1 mL尿酸鈉溶液（0.5 g/10 mL），建立AGA模型[9]。造模后，各給藥組ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)2 d。

2.3 厚藤提取物對(duì)AGA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)和右后足墊厚度的影響

造模后觀察各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹和右后足墊腫脹程度，并計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)。

關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)＝測(cè)定時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)周徑－初始關(guān)節(jié)周徑

2.4 厚藤提取物對(duì)AGA大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平的影響

大鼠禁食不禁水12 h，末次給藥后1 h，腹主動(dòng)脈采血至含肝素鈉的采血管中，3000 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書測(cè)定各組大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平。

2.5 厚藤提取物對(duì)AGA大鼠滑膜組織病理變化的影響

大鼠脫頸椎處死，取各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織，浸泡于4%多聚甲醛中，脫鈣后包埋于石蠟中制成組織塊，隨后采用蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察滑膜組織病理變化。

2.6 供試品溶液的制備

取適量厚藤提取物稠膏于蒸發(fā)皿中，55 ℃水浴烘干，取0.1 g提取物粉末，精密稱定，加入20 mL 50%甲醇，密塞稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，冷卻至室溫后再次稱定質(zhì)量，以50%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.7 對(duì)照品溶液的制備

分別取秦皮乙素、咖啡酸、異槲皮苷、異莨菪亭、綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇配制成各成分質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。分別取異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、阿魏酸適量，加入甲醇配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.8 血漿樣品的制備

將正常給藥組、對(duì)照組、模型組、厚藤提取物高劑量組同組血漿混合，各吸取1 mL，加入3倍量甲醇-乙腈（1∶1）溶液沉淀蛋白，渦旋3 min，4 ℃、15 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，氮?dú)獯蹈芍凉虪睿瑲堅(jiān)尤?00 μL甲醇，超聲3 min，渦旋混勻1 min，4 ℃、15 000 r/min離心10 min，吸取上清液進(jìn)行分析。

2.9 厚藤成分庫的建立

通過CNKI、PubMed等數(shù)據(jù)庫檢索與厚藤相關(guān)的文獻(xiàn)，對(duì)厚藤的化學(xué)成分進(jìn)行總結(jié)，共檢索到119個(gè)化學(xué)成分；利用ChemBioDraw軟件、PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Chemicalbook（https://m.chemicalbook.com/）等平臺(tái)收集化學(xué)成分的名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式、相對(duì)分子質(zhì)量等信息。

2.10 色譜條件

Hypersil Gold色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），洗脫程序：0～30 min，5%～95% B；體積流量為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為3 μL；柱溫為40 ℃。

2.11 質(zhì)譜條件

雙噴霧TurboV離子源；正/負(fù)離子掃描方式；掃描范圍為/100～1500；正離子源電壓為5500 V，負(fù)離子源電壓為?4500 V；離子源溫度為600 ℃；霧化氣壓力為55 psi（1 psi＝6.895 kPa），輔助氣壓力為55 psi，氣簾氣壓力為35 psi；母離子碰撞能量為?10 V；去簇電壓為?80 V；子離子碰撞能量為?35 V。

2.12 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 厚藤提取物對(duì)AGA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，造模后第4～24小時(shí)，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)顯著升高（＜0.01），于造模后第12小時(shí)達(dá)到腫脹高峰。與模型組比較，造模后第24～48小時(shí)，厚藤提取物組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.2 厚藤提取物對(duì)AGA大鼠右后足墊厚度的影響

如表2所示，與對(duì)照組比較，造模后第4～24小時(shí)，模型組大鼠右后足墊厚度顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，造模后第8、24小時(shí)，厚藤提取物組大鼠右后足墊厚度顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.3 厚藤提取物對(duì)AGA大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平的影響

如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，厚藤提取物高、中劑量組大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平顯著降低（＜0.05）。

表1 厚藤提取物對(duì)AGA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)的影響()

與對(duì)照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

表2 厚藤提取物對(duì)AGA大鼠右后足墊厚度的影響()

表3 厚藤提取物對(duì)AGA大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平的影響()

3.4 厚藤提取物對(duì)AGA大鼠滑膜組織病理變化的影響

如圖1所示，對(duì)照組大鼠滑膜結(jié)構(gòu)清晰完整，滑膜組織無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生；模型組大鼠滑膜襯里層較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以核分葉的中性粒細(xì)胞和圓形深染的淋巴細(xì)胞為主，有少量滑膜細(xì)胞變性壞死，壞死細(xì)胞核固縮或崩解、胞質(zhì)淡染，血管輕度充血且擴(kuò)張，管腔內(nèi)充斥大量紅細(xì)胞；秋水仙堿組和厚藤提取物高、中劑量組大鼠滑膜結(jié)構(gòu)較清晰，少量襯里層組織脫落，襯里層內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕；厚藤提取物低劑量組大鼠滑膜仍有輕度充血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。

圖1 厚藤提取物對(duì)AGA大鼠滑膜組織病理變化的影響(HE, ×400)

3.5 厚藤提取物中的化學(xué)成分及其質(zhì)譜裂解規(guī)律解析

采用LC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，參照厚藤成分庫、SCIEX數(shù)據(jù)庫、對(duì)照品比對(duì)及現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)厚藤提取物中的主要成分進(jìn)行分析，共鑒定出53個(gè)化學(xué)成分，包括樹脂糖苷類成分3個(gè)、黃酮類成分10個(gè)、有機(jī)酸類成分26個(gè)、香豆素類成分5個(gè)、核苷類成分2個(gè)、氨基酸類成分2個(gè)、萜類成分2個(gè)、木脂素類成分1個(gè)、刺五加苷類成分1個(gè)和維生素類成分1個(gè)，并推測(cè)了部分化學(xué)成分的裂解途徑。厚藤提取物總離子流圖見圖2，鑒定成分及碎片信息見表4。

圖2 負(fù)離子模式(A) 和正離子模式(B)下厚藤水提取物的總離子流圖

表4 厚藤提取物中化學(xué)成分的鑒定

續(xù)表4

續(xù)表4

3.5.1 樹脂糖苷類化合物質(zhì)譜分析 樹脂糖苷類化合物又稱大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，一般由長(zhǎng)鏈脂肪酸作為苷元與不同數(shù)量、種類的單糖形成內(nèi)酯，主要分布于旋花科番薯屬植物中[29]。以pescapreins XXX為例，負(fù)離子模式下，得到/1 267.705 3 [M＋FA－H]－的準(zhǔn)分子離子峰；二級(jí)碎片離子/1 221.700 4為丟失甲酸形成的[M－H]－的離子峰，/1 049.557 3為丟失一長(zhǎng)鏈脂肪酸形成的碎片離子[M－H－C10H20O2]－，/417.285 8為/1 049.557 3發(fā)生糖苷鍵斷裂形成的[M－H－C10H20O2－C29H44O15]－的碎片離子，/163.061 6為/417.285 8丟失長(zhǎng)鏈脂肪酸形成的[M－H－C10H20O2－C29H44O15－C16H30O2]－；根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)碎片裂解方式，鑒定為pescapreins XXX，其二級(jí)質(zhì)譜圖見圖3，可能的裂解途徑見圖4。

圖3 pescapreins XXX的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖4 pescapreins XXX的質(zhì)譜主要斷裂途徑

3.5.2 黃酮類化合物質(zhì)譜分析 黃酮類化合物在自然界廣泛存在，是中草藥的主要有效成分之一。以化合物32、33為例，在負(fù)離子模式下，R分別為5.52、5.66 min，分別得到/463.086 1 [M－H]－和/463.086 7 [M－H]－的準(zhǔn)分子離子峰，在二級(jí)質(zhì)譜信息中都具有/300、301、271、255的碎片，分別對(duì)應(yīng)[M－H－Glc－H]－、[M－H－Glc]－、[M－H－Glc－CO－2H]－、[M－H－Glc－CO－OH－H]－，根據(jù)其裂解規(guī)律文獻(xiàn)對(duì)照[22]推測(cè)為異槲皮苷或槲皮素-7--β--葡萄糖苷，因R不同，依據(jù)反相色譜柱洗脫原理，鑒定化合物32為異槲皮苷，化合物33為槲皮素-7--β--葡萄糖苷，其二級(jí)質(zhì)譜圖見5，以異槲皮苷為例，可能的裂解途徑見圖6。

3.5.3 有機(jī)酸類化合物質(zhì)譜分析 厚藤含有的有機(jī)酸類成分較多，主要為2～3種成分的同分異構(gòu)體及其衍生物的奎尼酸類成分，在二級(jí)質(zhì)譜中容易丟失H2O、CO2等分子?；衔?7、38、42的R分別為6.24、6.35、6.94 min，在負(fù)離子模式下，得到相同/515 [M－H]－的分子離子峰，在二級(jí)質(zhì)譜中，因失去2個(gè)咖啡?；?，具有/353、191、179、173的特征性碎片離子，推測(cè)為異綠原酸。異綠原酸B對(duì)照品的R為6.14 min，異綠原酸A對(duì)照品的R為6.26 min，異綠原酸C對(duì)照品的R為6.80 min，都具有/353、191、179、173、135的二級(jí)碎片，根據(jù)與對(duì)照品比對(duì)、反相色譜柱洗脫原理及文獻(xiàn)對(duì)照[20]，推測(cè)化合物37、38、42分別為異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C。以異綠原酸A為例，其二級(jí)質(zhì)譜圖見圖7，可能的斷裂途徑見圖8。

圖5 異槲皮苷(A)和槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(B) 的二級(jí)質(zhì)譜

圖7 異綠原酸A的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖8 異綠原酸A的質(zhì)譜主要斷裂途徑

3.5.4 香豆素類化合物質(zhì)譜分析 以化合物12為例，R為2.50 min，準(zhǔn)分子離子峰為/339.072 7 [M－H]－，二級(jí)質(zhì)譜信息顯示有/177.019 5、133.030 4，是由準(zhǔn)分子離子丟失1個(gè)Glc，繼續(xù)丟失1個(gè)CO2形成的碎片離子，根據(jù)該化合物一級(jí)質(zhì)譜信息、二級(jí)裂解方式及文獻(xiàn)報(bào)道[10]，鑒定為秦皮甲素，其二級(jí)質(zhì)譜圖見圖9，可能的裂解途徑見圖10。

化合物28的R為5.09 min，在正離子模式下得到/193.048 9 [M＋H]＋的準(zhǔn)分子離子峰，以該母離子進(jìn)行MS/MS掃描，得到二級(jí)碎片離子/178.028 0，為準(zhǔn)分子離子丟失1分子CH3形成；碎片離子/133.029 9為準(zhǔn)分子離子丟失1分子CH3OH繼而丟失1分子CO形成；碎片離子/150.033 2為母離子丟失1分子CH3后，再丟失1分子CO形成，繼續(xù)丟失1分子CO形成/122.038 1的離子碎片。根據(jù)以上裂解方式，結(jié)合對(duì)照品及文獻(xiàn)比對(duì)[14]，鑒定該化合物為異莨菪亭。其二級(jí)質(zhì)譜圖見圖11，可能的裂解途徑見圖12。

圖9 秦皮甲素的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖10 秦皮甲素的質(zhì)譜主要斷裂途徑

3.6 厚藤在正常及AGA大鼠中入血成分鑒定

將對(duì)照組、正常給藥組、模型組、厚藤高劑量組血漿樣品分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行分析，給藥組得到的數(shù)據(jù)扣除對(duì)照組的內(nèi)源性成分，篩選只含在給藥組血漿樣品而不在對(duì)照組血漿樣品的成分為入血成分；同理，厚藤高劑量組得到的數(shù)據(jù)扣除模型組的內(nèi)源性成分。將入血成分的精確相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)碎片等信息與厚藤提取物鑒定結(jié)果比對(duì)，若一致，則為原型入血成分。從正常給藥組初步鑒定4個(gè)入血成分，從厚藤提取物高劑量組初步鑒定出4個(gè)入血成分，2組中相同成分有3個(gè)。入血成分鑒定信息見表5、6，總離子流圖見圖13、14，提取離子流色譜圖見圖15、16。

3.7 厚藤在正常及AGA大鼠中入血成分分析

正常大鼠血漿中，R為0.69 min的化合物在負(fù)離子模式下，得到/133.0146 [M－H]－的準(zhǔn)分子離子峰，其二級(jí)碎片主要有/115.005 7 [M－H－H2O]－、/71.014 5 [M－H－H2O－COOH]－，根據(jù)該化合物精確相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)質(zhì)譜信息，并和厚藤提取物鑒定結(jié)果比對(duì)，鑒定為蘋果酸，其二級(jí)質(zhì)譜圖見圖17。R為2.87 min的化合物在負(fù)離子模式下，得到/179.035 3 [M－H]－的準(zhǔn)分子離子峰，二級(jí)質(zhì)譜信息顯示主要有/135.0450 [M－H－COOH]－，根據(jù)該化合物精確相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)質(zhì)譜信息，并和厚藤提取物鑒定結(jié)果比對(duì)，鑒定為咖啡酸，其二級(jí)質(zhì)譜圖見圖17。R為3.04 min的化合物在負(fù)離子模式下，得到/193.050 6 [M－H]－的準(zhǔn)分子離子峰，比咖啡酸準(zhǔn)分子離子峰/179 [M－H]－多14，提示增加1個(gè)CH2，發(fā)生甲基化反應(yīng)，結(jié)合二級(jí)碎片信息/178.025 7 [M－H－CH3]－、/134.037 4 [M－H－CO2－CH3]－，與咖啡酸二級(jí)質(zhì)譜信息比較，符合咖啡酸甲基化過程。根據(jù)該化合物一級(jí)質(zhì)譜信息、二級(jí)質(zhì)譜信息并與文獻(xiàn)比對(duì)，鑒定為咖啡酸甲酯[30]，其二級(jí)質(zhì)譜圖見圖17。R為6.31 min的化合物在負(fù)離子模式下，得到/137.024 5 [M－H]－的準(zhǔn)分子離子峰，二級(jí)碎片主要有/93.034 9 [M－H－CO2]－、/65.040 0 [M－H－CO2－CO]－，根據(jù)該化合物一級(jí)質(zhì)譜信息、二級(jí)質(zhì)譜信息并與文獻(xiàn)對(duì)照[31]，鑒定為對(duì)羥基苯甲酸，推測(cè)為單咖啡?；鼘幩犷悾ňG原酸、新綠原酸、隱綠原酸）在體內(nèi)代謝成奎尼酸而進(jìn)一步代謝生成對(duì)羥基苯甲酸[32-33]，或是原兒茶酸在體內(nèi)發(fā)生去羥基化反應(yīng)生成，其二級(jí)質(zhì)譜圖見圖17。

圖11 異莨菪亭的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖12 異莨菪亭的質(zhì)譜主要斷裂途徑

表5 厚藤提取物在正常大鼠中入血成分鑒定結(jié)果

表6 厚藤提取物在AGA大鼠中入血成分鑒定結(jié)果

圖13 負(fù)離子模式下對(duì)照組(A)、空白給藥組(B)、模型組(C) 和厚藤提取物高劑量組(D) 血漿樣本的總離子流圖

圖14 正離子模式下對(duì)照組(A)、空白給藥組(B)、模型組(C) 和厚藤提取物高劑量組(D) 血漿樣本的總離子流圖

圖15 厚藤提取物在正常大鼠中入血成分的提取離子流色譜圖

圖16 厚藤提取物在AGA大鼠中入血成分的提取離子流色譜圖

AGA大鼠血漿中，R為3.02的化合物在正離子模式下，得到/193.050 1 [M＋H]＋的準(zhǔn)分子離子峰，其二級(jí)碎片主要有/178.026 8 [M＋H－CH3]＋、/150.033 0 [M＋H－CH3－CO]＋、/133.030 7 [M＋H－CH3－CO2]＋，根據(jù)該化合物精確相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)質(zhì)譜信息，并與厚藤提取物鑒定結(jié)果比對(duì)，鑒定為莨菪亭，其二級(jí)質(zhì)譜圖見圖17。AGA大鼠中移行成分除莨菪亭外，其余鑒定成分均與厚藤提取物在正常大鼠血漿中移行成分一致。

4 討論

AGA是尿酸鈉晶體沉積所致的關(guān)節(jié)疾病，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛，在中醫(yī)屬“痹證”等范疇[34-35]。其發(fā)病機(jī)制主要涉及代謝、免疫調(diào)節(jié)與炎癥反應(yīng)。單鈉尿酸鹽作為危險(xiǎn)信號(hào)，可活化含NLR家族Pyrin域蛋白3（NLR family Pyrin domain containing protein 3，NLRP3）炎癥小體，產(chǎn)生大量IL-1β，引起炎癥反應(yīng)[36]，IL-1β在AGA的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。單鈉尿酸鹽晶體可迅速誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞趨化因子MIP-1α、MIP-2水平升高，促使巨噬細(xì)胞活化[37]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)、足墊顯著腫脹，血清中IL-1β、MIP-1α、MIP-2水平均升高，滑膜組織有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管充血現(xiàn)象，表明AGA模型制備成功；與模型組比較，秋水仙堿組和厚藤提取物高、中劑量組大鼠關(guān)節(jié)及足墊腫脹明顯緩解，血清中IL-1β、MIP-1α、MIP-2水平均降低，滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，表明厚藤提取物可抑制AGA大鼠炎癥反應(yīng)。

傳統(tǒng)中藥為口服中藥，口服藥進(jìn)入機(jī)體后經(jīng)歷復(fù)雜的代謝過程，只有吸收入血的成分才可能發(fā)揮藥效。中藥血清藥物化學(xué)的概念，為研究中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了科學(xué)方法[38]。本研究采用LC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)首先對(duì)厚藤提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行表征，繼而對(duì)厚藤提取物在正常大鼠及AGA大鼠中的入血成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明，厚藤提取物中主要成分為有機(jī)酸類化合物，其中主要包括咖啡酸、綠原酸、異綠原酸等奎尼酸類化合物及其衍生物，其次為山柰酚、異槲皮苷等黃酮類化合物。有機(jī)酸類[39]和黃酮類[40]成分具有抗炎活性，與厚藤的傳統(tǒng)藥效吻合。中藥血清藥物化學(xué)研究的給藥設(shè)計(jì)、采血時(shí)間及采血方式有多種，本研究采取與厚藤提取物高劑量組同等劑量、1次/d、連續(xù)7 d的給藥方式，確保中藥絕大多數(shù)成分在體內(nèi)血藥濃度維持在一個(gè)基本穩(wěn)定的水平。研究發(fā)現(xiàn)[41]，最佳的采血時(shí)間是在動(dòng)物給藥后0.5～2 h。采血方式通常有腹主動(dòng)脈采血、眼眶靜脈叢采血等方法。腹主動(dòng)脈采血可獲得大量血液且不易發(fā)生溶血，適用于單次采血；眼眶靜脈叢采血可實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)多次取血，但采血量較少。因考慮與厚藤提取物在AGA大鼠入血成分研究的采血方式平行，若采用眼眶靜脈叢多次采血可能會(huì)對(duì)大鼠產(chǎn)生炎癥或應(yīng)激反應(yīng)的影響，且AGA為急性模型，大鼠會(huì)出現(xiàn)自愈現(xiàn)象，不能確保末次采血時(shí)動(dòng)物維持在病理狀態(tài)。綜上，本研究采取末次給藥后1 h腹主動(dòng)脈采血。ig厚藤提取物后，從正常大鼠血漿中鑒定出蘋果酸、咖啡酸、咖啡酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸4種成分；在AGA大鼠血漿中鑒定出咖啡酸、莨菪亭、咖啡酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸4種成分，除莨菪亭外，其余成分均與厚藤提取物在正常大鼠血漿中移行成分一致。造成上述情況的原因可能是大鼠在正常狀態(tài)和病理狀態(tài)下對(duì)藥物的吸收有一定差異[42]。在病理狀態(tài)下檢測(cè)厚藤入血成分更能體現(xiàn)藥物臨床病理狀態(tài)下體內(nèi)過程的特點(diǎn)。其中，莨菪亭為原型成分吸收入血，咖啡酸不僅是厚藤中的化學(xué)成分，也是綠原酸及其異構(gòu)體（新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C）水解后的代謝產(chǎn)物[32-33,43]，咖啡酸甲酯為咖啡酸發(fā)生甲基化反應(yīng)形成，對(duì)羥基苯甲酸可由單咖啡酰基奎寧酸類代謝產(chǎn)生或由原兒茶酸發(fā)生去羥基化反應(yīng)生成。因此，莨菪亭、咖啡酸、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C及原兒茶酸可作為厚藤治療AGA的Q-Marker。研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸可有效緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）大鼠足腫脹和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，降低足跖中核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、殼多糖酶3樣蛋白1（chitinase-3-like protein 1，CHI3L1）、IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表達(dá)，從而發(fā)揮抗RA作用[44]。原兒茶酸能夠抑制NF-κB和蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白（Akt/mTOR）信號(hào)通路，從而抑制RA成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖與遷移[45]。異綠原酸A抗炎活性可能與抑制NLRP3炎性復(fù)合體激活和NF-κB磷酸化表達(dá)有關(guān)[46]。綠原酸和咖啡酸可通過清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），抑制p38級(jí)聯(lián)磷酸化和NF-κB信號(hào)通路來抑制IL-8生成，從而發(fā)揮抗炎作用[47]。莨菪亭能夠通過作用于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）/環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）通路，抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，從而改善佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜炎癥和軟骨破壞[48]。本研究鑒定到的原型成分較少，在二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子響應(yīng)較低，推測(cè)可能為中藥水煎液成分復(fù)雜，各成分含量較低，導(dǎo)致吸收入血的藥物濃度更低。

A-蘋果酸 B-咖啡酸 C-咖啡酸甲酯 D-對(duì)羥基苯甲酸 E-異莨菪亭

課題組前期[49]采用薄層色譜法以咖啡酸為對(duì)照品，對(duì)厚藤進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液相色譜法檢測(cè)了厚藤提取物中咖啡酸、異槲皮苷、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 6個(gè)成分的含量，發(fā)現(xiàn)咖啡酸等酚酸類成分可作為厚藤的Q-Marker。本研究基于傳統(tǒng)功效-藥理活性-活性成分的思路，運(yùn)用LC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，從“有效性”和“可測(cè)性”[50]確定厚藤治療AGA的Q-Marker，為進(jìn)一步開展厚藤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、體內(nèi)過程及作用機(jī)制研究提供思路和基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on Q-Marker for treating acute gouty arthritis withbased on serum pharmacochemistry

HOU Xiao-tao1, 2, WEI Yan-ting1, 2, XIA Zhong-shang2, 3, WEI Wei2, HAO Er-wei2, DU Zheng-cai2, ZHOU Yue-min1, DENG Jia-gang2

1. Faculty of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 2. Guangxi Key Laboratory of Efficacy Study on Chinese Materia Medica, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 3. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To study the therapeutic effect ofextract on acute gouty arthritis (AGA) rats and analyze the transitional components in blood of normal rats and AGA rats based on theory of quality marker (Q-Marker) of traditional Chinese medicine, and provide experimental basis for the determination of Q-Marker.AGA model was induced by sodium urate. The effect ofextract on joint swelling index, foot pad swelling and synovial tissue pathological changes in AGA rats were evaluated. The effect ofextract on interleukin-1β (IL-1β), macrophage inflammatory protein-1α (MIP-1α), and MIP-2 levels in serum of AGA rats were observed. LC-Q-TOF-MS/MS was used to qualitatively analyzeextract, and then the blood components of normal rats and AGA rats were identified after igextract.Compared with model group, joint swelling index and foot pad thickness of rats inextract group were significantly decreased (< 0.05, 0.01), IL-1β, MIP-1α, and MIP-2 levels in serum of high- and medium-doseextract groups were significantly decreased (< 0.05), infiltration of inflammatory cells in synovial tissue were reduced in high- and medium-doseextract groups. 53 components were identified fromextract, including resin glycosides, flavonoids, organic acids, coumarins, nucleosides, lignans, among which organic acids and flavonoids were the main components. Fragmentation rules of some compounds of resin glycosides, flavonoids, organic acids, and coumarins were also speculated. Four components including malic acid, caffeic acid, methyl caffeic acid and 4-hydroxybenzoic acid were identified in normal rat sample plasma. Four components including scopoletin, caffeic acid, methyl caffeic acid, and 4-hydroxybenzoic acid were identified in AGA rat sample plasma.extract can significantly relieve joint swelling of AGA rats, inhibit IL-1β, MIP-1α, and MIP-2 levels in serum, and inhibit inflammatory response. Main chemical components fromextract were rapidly identified as organic acids and flavonoids by using LC-Q-TOF-MS/MS. Scopoletin, caffeic acid, chlorogenic acid and its isomers (neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C) and protocatechuic acid were injected into the blood in form of prototype components or their metabolites in AGA rats, which could be used as Q-Marker for the treatment of AGA withextract.

(Linn.) Sweet; acute gouty arthritis; quality marker; LC-Q-TOF-MS/MS; scopoletin; caffeic acid; chlorogenic acid; neochlorogenic acid; cryptochlorogenic acid; isochlorogenic acid B; isochlorogenic acid A; isochlorogenic acid C; protocatechuic acid

R285.5；R285.61

A

0253 - 2670(2021)09 - 2638 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.015

2021-04-10

廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行補(bǔ)助項(xiàng)目（20-065-38）；廣西一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目重點(diǎn)課題（2018XK043）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)一般碩士研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（YCSY2020026）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)自治區(qū)級(jí)碩士研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（YCSW2019170）；中國(guó)東盟傳統(tǒng)藥物研究國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室建設(shè)（二期）資助項(xiàng)目（桂科AD19110165）；農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目（CICAR2020）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)岐黃工程高層次人才團(tuán)隊(duì)培育項(xiàng)目（2018006）

侯小濤（1969—），女，博士，教授，從事中藥活性成分及質(zhì)量控制研究。Tel: 13878858205 E-mail: xthou@126.com

鄧家剛，教授。E-mail: dengjg53@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]