劉牧秋，余嘉慧，高安然，陳光星

(1. 廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405;2. 廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心，廣東 廣州 510405；3. 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405)

類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以全身關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、僵硬為主要臨床表現(xiàn)的慢性自身免疫疾病，往往可導致不可逆的關(guān)節(jié)損傷、畸形甚至殘疾?，F(xiàn)代醫(yī)學治療RA的常見藥物包括非甾體抗炎藥、抗風濕藥物(DMARDS)和糖皮質(zhì)激素,然而這些藥物伴隨諸多不良反應(yīng)，包括感染、惡心、嘔吐、消化道刺激反應(yīng)、口腔炎癥、皮疹、脫發(fā)、骨髓抑制和肝臟毒性[1-2]。事實上，RA的中西醫(yī)結(jié)合治療具有更客觀的優(yōu)勢，有更穩(wěn)定、更顯著的療效，并有效降低了不良反應(yīng)的概率[3-4]。全國名老中醫(yī)專家、廣東省中醫(yī)風濕疾病重點專科專病學術(shù)帶頭人、廣州中醫(yī)藥大學首席教授陳紀藩教授認為，RA病因病機為肝腎、氣血虧虛為本，風寒濕侵襲為標，扶正祛邪是治療RA的基本原則。加味通痹湯(昆明山海棠、枸杞子、丹參、杜仲、女貞子、墨旱蓮)為陳紀藩教授的經(jīng)驗方，治療上重視益腎養(yǎng)陰，兼顧祛風勝濕，化瘀涼血，在臨床應(yīng)用上已取得了可觀的療效，研究證實可顯著緩解活動期RA患者疼痛、腫脹癥狀，改善C反應(yīng)蛋白、血沉等炎癥指標[5]。二至丸(女貞子、墨旱蓮)具有益腎養(yǎng)陰的名方，主治腰膝疼痛、骨蒸潮熱、月經(jīng)量多等。二至丸為加味通痹湯的重要組方，寓有通過滋補腎陰、固本扶正而祛邪外出之意。臨床案例證實，單用女貞子一味中藥可明顯減輕RA患者關(guān)節(jié)腫痛，降低類風濕因子水平[6]；藥理研究表明而二至丸具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤等功效[7]，但尚無研究闡明二至丸對防治RA的作用機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學是基于生物信息學，闡釋中草藥“成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)作用關(guān)系的研究方法[8]，取代了藥物作用單一靶點的傳統(tǒng)研究思路。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)，深入挖掘二至丸抗RA的作用靶點及通路，并探討中醫(yī)證型腎陰虛與RA現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)病機制的潛在內(nèi)涵，為后續(xù)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1二至丸活性成分 本研究將關(guān)鍵詞“女貞子”“墨旱蓮”分別輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫(中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺，http:// tcmspw.com/tcmsp. php)，以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為篩選條件,挖掘二至丸的活性成分。

1.2二至丸作用靶點 STITCH(http://stitch.embl.de)是檢索化合物與蛋白靶點(包括驗證靶點及預(yù)測靶點)相互作用關(guān)系平臺。本研究通過STITCH及TCMSP數(shù)據(jù)庫的靶點預(yù)測模塊，輸入二至丸活性成分，得到相應(yīng)靶點。登錄Uniprot 數(shù)據(jù)庫(https:// www.uniprot.org)，限定物種為“Homo sapiens”，校正靶點信息，并將靶點進行基因名與蛋白名的轉(zhuǎn)換。

1.3二至丸抗RA靶點 TTD(https://db. idrblab. org /ttd)是提供藥物、靶點、靶向疾病及對應(yīng)通路關(guān)系的數(shù)據(jù)庫。DisGeNET (https:// www.disgenet.org)是整合疾病與基因關(guān)聯(lián)信息的綜合性數(shù)據(jù)庫。OMIM (https:// www.omim. org)是在線孟德爾人類遺傳數(shù)據(jù)庫，提供所有遺傳疾病基因信息。本研究以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞，通過TTD、DisGeNET、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取RA相關(guān)基因。整合二至丸作用靶點及RA相關(guān)基因，取二者交集，得到二至丸治療RA的靶點數(shù)據(jù)。

1.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 STRING是闡明功能蛋白相互作用關(guān)系平臺。PPI網(wǎng)絡(luò)(蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，protein-protein interaction network)揭示靶點之間關(guān)系，有助于從分子角度闡明機體生理病理機制。在STRING中輸入二至丸抗RA靶點,作用閾值設(shè)置為0.900(最高)，結(jié)合Cytoscape 3.2.1構(gòu)建可視化PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中“節(jié)點”表示靶點，“邊”表示作用關(guān)系。以網(wǎng)絡(luò)拓撲分析的度中心性(degree centrality,DC)、介數(shù)中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)為參數(shù)衡量網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的重要性和關(guān)鍵程度，通過Cytoscape的“network analysis”功能，以DC、BC、CC大于中位數(shù)為條件，篩選出hub節(jié)點(為網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點)。選取hub節(jié)點再次構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5靶點-成分互作網(wǎng)絡(luò) 從上述1.3數(shù)據(jù)中挖掘關(guān)鍵靶點所關(guān)聯(lián)的成分及其相互作用關(guān)系。用Cytoscape 3.2.1軟件建立關(guān)鍵靶點與關(guān)聯(lián)成分相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并計算節(jié)點DC值。節(jié)點DC越大，與其他節(jié)點互作關(guān)系越多。

1.6GO富集分析及KEGG通路富集分析 David 6.8(https://david.ncifcrf. gov/tools. jsp)是為基因或蛋白提供生物功能注釋信息的在線工具。在David 6.8中導入二至丸治療RA靶點，設(shè)置FDR(false discovery rate,錯誤發(fā)現(xiàn)率)<0.01，進行GO(gene oncology,基因本體)富集分析，以闡釋基因的共同生物功能，包括了分子功能、生物學過程、細胞組件3個模塊。同時利用David 6.8進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,基因組百科全書數(shù)據(jù)庫)信號通路富集分析，設(shè)置FDR<0.05，結(jié)合文獻挖掘篩選與RA相關(guān)的信號通路，記錄通路所富集的基因及P值(false positive rate,假陽性率)，并用R軟件繪制氣泡圖。

1.7分子對接 采用Autodock 4.0軟件對二至丸和核心活性成分和抗RA的關(guān)鍵靶點進行分子對接分析。Autodock是一種分子模擬的自動化程序，使分子之間通過幾何匹配和能量匹配相互識別，從而預(yù)測配體和蛋白靶標之間相互作用關(guān)系[9]。在PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)中下載關(guān)鍵靶點蛋白結(jié)構(gòu)的pdb格式文件，運用pymol軟件對蛋白進行修飾，移除配體、水分子。在ZINC數(shù)據(jù)庫(http://zinc.docking.org)下載活性成分2D結(jié)構(gòu)式的mol2文件。運用Autodock 4.0軟件將pdb和mol2文件轉(zhuǎn)化為pdbqt格式文件后，進行分子對接并計算結(jié)合能，結(jié)合能越小則配體與受體親和力強，所需能量越少。結(jié)合能小于0說明受體和配體之間可自發(fā)結(jié)合。

2 結(jié) 果

2.1二至丸活性成分篩選 我們在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索出女貞子119種成分，墨旱蓮48種成分，基于OB、DL篩選及刪除重復(fù)后有21個活性成分納入研究，見表1。

2.2二至丸治療RA活性成分靶點 在STITCH、TCMSP數(shù)據(jù)庫挖掘二至丸活性成分對應(yīng)的131個靶點。在DisGeNET、TTD、OMIM數(shù)據(jù)庫得到RA相關(guān)基因1 908個。取交集后篩選出75個二至丸治療RA的靶點。

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 本研究利用75個靶點繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖1A)，計算網(wǎng)絡(luò)拓撲分析3個參數(shù)的中位數(shù)后，設(shè)置DC≥32，BC≥0.005，CC≥0.418，得到25個Hub節(jié)點，為二至丸治療RA的關(guān)鍵靶點，關(guān)鍵靶點信息見表2。利用此25個hub節(jié)點再次建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖1B)。其中TP53、MAPK1、JUN、SRC的度中心性值較高(DC≥21)，在介導RA生物過程中起到重要作用。

表1 二至丸21個活性成分基本信息

A：75個二至丸抗RA靶點互作關(guān)系；B:25個關(guān)鍵靶點互作關(guān)系圖1 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4成分-關(guān)鍵靶點互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 本研究發(fā)現(xiàn)25個關(guān)鍵靶點與12個二至丸活性成分具有相互作用關(guān)系，成分-關(guān)鍵靶點互作網(wǎng)絡(luò)見圖2。我們認為此12個成分為二至丸抗RA的核心活性成分，見表3。二至丸中槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚等活性成分關(guān)聯(lián)多個關(guān)鍵靶點(DC≥6)，在治療RA藥理機制中起到重要作用。

2.5GO富集分析 本研究對75個二至丸治療RA的靶點進行GO富集分析，得到46條GO途徑滿足FDR<0.01，絕大多數(shù)屬于生物學過程模塊，按照P值從小到大對GO途徑進行排列，篩選出屬于生物學過程模塊的前15條GO途徑，包括了 RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，DNA模板、細胞對缺氧的反應(yīng)、凋亡過程的負調(diào)控、對藥物的反應(yīng)、細胞對脂多糖的反應(yīng)、基因表達的正調(diào)控、老化、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、細胞對腫瘤壞死因子的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、血管生成、對缺氧的反應(yīng)、細胞老化、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控(見圖3A)。如圖所示，橫坐標表示P值，縱坐標表示各項生物學過程。綜上，二至丸防治RA的生物過程主要與增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)、血管生成相關(guān)。

表2 二至丸抗RA的21個關(guān)鍵靶點基本信息

圖2 成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表3 成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)圖中12個核心活性成分基本信息

2.6KEGG信號通路富集分析 KEGG富集分析后得到13條與RA相關(guān)的信號通路，見圖3B及表4。圖中表明，二至丸抗RA作用機制主要通過介導TNF信號通路、HIF-1信號通路等。

2.7分子對接結(jié)果 本研究將活性成分槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚與靶點TP53、MAPK1、JUN、SRC進行分子對接，見表5。結(jié)果提示結(jié)合能均小于0，配體槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚與受體TP53、MAPK1、JUN、SRC可自發(fā)結(jié)合并相互作用。

圖3 GO估計分析柱狀圖及KEGG信號通路富集分析氣泡圖

表4 二至丸治療RA相關(guān)13條信號通路具體信息

3 討 論

RA是累及全身多關(guān)節(jié)、多臟器的慢性炎癥性自身免疫性疾病，其發(fā)病機制非常復(fù)雜，主要與關(guān)節(jié)滑膜炎癥及骨質(zhì)破壞相關(guān)[10]。其中RA發(fā)病的重要環(huán)節(jié)為滑膜成纖維細胞(RA-FLS)的異常增殖，產(chǎn)生大量促炎細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等，導致局部炎癥，損傷關(guān)節(jié)軟骨[11]。

表5 分子對接結(jié)果

加味通痹湯是名老中醫(yī)陳紀藩教授治療RA的驗方，而二至丸是其重要組成部分，通過補腎陰、扶正氣而除風濕外邪。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)，發(fā)現(xiàn)二至丸抗RA的核心活性成分為槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚等，關(guān)鍵靶點為TP53、MAPK1、JUN、SRC等。這些關(guān)鍵靶點參與多條通路的信號轉(zhuǎn)導，其中TP53(腫瘤抑制基因p53)與RA-FLS凋亡相關(guān)，而RA滑膜組織中TP53基因突變增多而功能缺失，抑制了RA-FLS的正常凋亡[12]。MAPK1組成MAPK通路中的關(guān)鍵分子細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK),調(diào)控有絲分裂及減數(shù)分裂，促進細胞增殖[13]。JUN組成轉(zhuǎn)錄因子AP-1，介導RA炎癥因子及MMPs的產(chǎn)生[14]。此外，SRC表達酪氨酸激酶，與RA炎癥反應(yīng)相關(guān)[15]。

滑膜炎致軟骨損傷是RA發(fā)病的關(guān)鍵。RA-FLS所產(chǎn)生的促炎細胞因子刺激滑膜細胞和軟骨細胞產(chǎn)生MMPs，造成RA軟骨降解[16],同樣RA-FLS具有腫瘤樣般異常增殖和遷移的特性，對軟骨造成侵蝕[17]。TNF信號通路是二至丸介導的最重要的信號通路。腫瘤壞死因子(TNF)為此通路的激活劑，TNF有2個受體(TNFR1和TNFR2)。TNFR1信號傳導下游的MAPK通路、NF-κB通路、細胞凋亡通路，TNFR2信號傳導下游的JNK通路及Akt依賴的NF-κB通路，達到多水平的促炎效果[18]。MAPK通路激活同樣促進炎癥因子表達，也與RA-FLS增殖、侵襲和遷移相關(guān)[19-20]。研究證實木犀草素、槲皮素、β-谷固醇、山奈酚可通過介導MAPK通路抑制RA-FLS異常增殖和侵襲，顯著下調(diào)MMPs水平[21-24]。

二至丸介導的HIF-1信號通路、T細胞受體信號通路、催乳素信號通路、Toll樣受體信號通路、Foxo信號通路等亦與抗滑膜炎癥、抑制損傷密切相關(guān)。HIF-1信號通路可通過激活轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α，上調(diào)VEGF的表達，有助于RA滑膜新生血管翳形成[25]，而滑膜血管翳形成是致RA軟骨損傷的重要病理基礎(chǔ)。T細胞受體信號通路誘導T細胞的增殖并分化成效應(yīng)T細胞，參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[26]。Toll樣受體途徑中Toll樣受體-3(TLR-3)在RA中高表達，參與了炎性因子如IL-6、IFN-β及MMP3的分泌[27]。在Foxo信號通路可控制RA-FLS受氧化應(yīng)激的影響，避免RA-FLS異常增殖[28]。處于哺乳期的RA婦女疾病活動度風險增加，提示RA催乳素之間的關(guān)聯(lián)。研究表明，催乳素(PRL)可由與RA發(fā)病相關(guān)的巨噬細胞、T細胞和滑膜成纖維細胞產(chǎn)生，催乳素受體(PRLR)在滑膜巨噬細胞、淋巴細胞和滑膜成纖維細胞中表達，PLR與PRLR結(jié)合上調(diào)炎性細胞因子IL-6，IL-12β，TNF的表達[29]。

RA的骨質(zhì)破壞來源于破骨細胞的過度增殖及分化，打破了骨代謝的平衡。RANKL(TNF超家族一員)與破骨細胞表面受體RANK結(jié)合激活破骨細胞分化通路，激活成熟破骨細胞，加速骨吸收進程[30]。而研究表明槲皮素具有抑制RANKL表達、抗破骨細胞分化作用[31]。此外對IL-6的應(yīng)答是造成RANKL的過表達的因素，并且促炎因子TNF-α、IL-17、IL-1β刺激IL-6的分泌[30]，因此抗炎為抑制RA骨質(zhì)破壞途徑。RA女性的發(fā)病率是男性的3倍，圍絕經(jīng)期為女性RA發(fā)病的高峰期，表明了雌激素與RA發(fā)病的關(guān)聯(lián)。在雌激素信號通路中，雌激素可抑制巨噬細胞和T細胞分泌促炎因子IL-1和TNF-α來控制破骨細胞分化進程，雌激素亦可通過誘導調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)的增殖和成熟，來抑制破骨細胞的發(fā)育，雌激素替代療法對預(yù)防RA婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松具有積極作用[32]。綜上，二至丸可通過抗炎，激活雌激素信號通路，抑制破骨細胞分化信號通路而抗RA骨質(zhì)破壞進程。

另一方面，二至丸為滋補腎陰的著名方劑，能有效減輕圍絕經(jīng)期婦女月經(jīng)紊亂、潮熱等癥狀，曾有國內(nèi)研究報道腎虛與雌激素減少具有正相關(guān)性[33]。我們認為，補腎陰中藥或可通過雌激素信號通路，控制圍絕經(jīng)期女性RA進展，雌激素信號通路被抑制可能為腎陰虛介導RA合并骨質(zhì)疏松的重要機制之一。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，推斷二至丸作為著名的滋腎陰方，主要藥理成分為槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚等，通過TP53、MAPK1、JUN、SRC等關(guān)鍵靶點，介導多條通路抑制RA-FLS的增殖和侵蝕軟骨，抑制RA-FLS分泌炎性細胞因子、MMPs，并且阻斷破骨細胞的分化途徑來控制骨質(zhì)破壞進程，達到防治RA的目的。此外本研究亦創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)，雌激素信號通路被抑制可能為腎陰虛型RA發(fā)病與進展的機制之一。以上結(jié)論有待進一步臨床及實驗研究驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。