笪 虎，張建中，宋建寬，徐長(zhǎng)明，熊 卓

(1.漣水縣人民醫(yī)院骨科，江蘇 漣水 223400；2.淮安市急救中心，江蘇 淮安 223001；3.清華大學(xué)機(jī)械工程系，北京 100084)

針對(duì)大段骨缺損，臨床上常使用組織工程骨進(jìn)行修復(fù)。其中，同種異體骨是重要的組織工程骨之一[1-2]。但是，同種異體骨細(xì)胞親和力(骨傳導(dǎo)能力)不強(qiáng)，宿主細(xì)胞難以在其微孔表面大量黏附與增殖，臨床治療效果不佳[3-4]。為增強(qiáng)同種異體骨的細(xì)胞親和力，本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)中，采用凍干法，使用多聚賴氨酸溶液對(duì)兔同種異體骨的微孔進(jìn)行表面改性，其細(xì)胞親和力得到了顯著提升；此外，該方法成本低廉，步驟簡(jiǎn)單，易于掌握和操作[5-7]。然而，有研究報(bào)道，多聚賴氨酸具有細(xì)胞毒性，可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)[8]。為了使同種異體骨表面改性后具有最佳的細(xì)胞親和力與最低的細(xì)胞毒性，本研究通過(guò)探討多聚賴氨酸溶液的最佳濃度，旨在為其今后的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

成年新西蘭大白兔由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，兔同種異體骨購(gòu)自西京醫(yī)院骨庫(kù)，左旋多聚賴氨酸(分子量15萬(wàn)～30萬(wàn))、L-抗壞血酸、地塞米松、胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉、噻唑藍(lán)(MTT)、DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma，D-Hank’s液、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibico，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 兔同種異體骨的表面改性和分組 兔同種異體骨均取自于兔椎體松質(zhì)骨，切割成邊長(zhǎng)為3 mm的正方體，然后分別浸入100 mg/mL、30 mg/mL、1 mg/mL、0.1 mg/mL、0.025 mg/mL和0.01 mg/mL的多聚賴氨酸溶液中，持續(xù)振蕩2 h，微孔被溶液充分浸透后取出，置于12孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔放置1粒。先在-20 ℃下預(yù)冷2 h，隨即轉(zhuǎn)至-80 ℃下冷凍1 h，最后置于冷凍干燥機(jī)中干燥24 h。根據(jù)同種異體骨所浸入的多聚賴氨酸濃度，將其分為100 mg/mL組、30 mg/mL組、1 mg/mL組、0.1 mg/mL組、0.025 mg/mL組和0.01 mg/mL組，未經(jīng)表面改性的同種異體骨納入空白對(duì)照組。各組同種異體骨均經(jīng)20 kGy60Co輻照滅菌，于4 ℃密封無(wú)菌保存。

1.2.2 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的分離與擴(kuò)增 以戊巴比妥麻醉新西蘭大白兔后，將其股骨大粗隆及周圍皮膚仔細(xì)反復(fù)消毒。持骨穿針，在股骨大粗隆處抽吸約0.5 mL骨髓，迅速滴入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每2 d半量換液1次。采用全骨髓貼壁法提純BMSCs。待細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，進(jìn)行消化、傳代。

1.2.3 BMSCs的種植、誘導(dǎo)和培養(yǎng) 第3代BMSCs置于成骨培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、50 mg/L L-抗壞血酸、1×10-8mol/L地塞米松和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的高糖DMEM)內(nèi)，制成細(xì)胞密度為1×107/mL的懸液。將含2×104個(gè)BMSCs的懸液滴入各組同種異體骨內(nèi)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后添加成骨培養(yǎng)基，每2 d半量換液1次。

1.2.4 MTT比色試驗(yàn)檢測(cè)BMSCs黏附、增殖的情況 在培養(yǎng)和誘導(dǎo)的第3、5、7、9、11、13、15、17天，每組分別隨機(jī)抽取8個(gè)標(biāo)本。D-Hank’s液漂洗去除未黏附的細(xì)胞后，采用MTT比色試驗(yàn)法，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度A值，利用表格記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組的吸光度A值，以間接檢測(cè)細(xì)胞在同種異體骨微孔表面黏附、增殖的情況。

1.2.5 檢測(cè)各組同種異體骨內(nèi)黏附細(xì)胞表達(dá)ALP的活性 在培養(yǎng)和誘導(dǎo)的第3、5、7、9、11、13、15、17天，每組分別隨機(jī)抽取8個(gè)標(biāo)本。D-Hank’s液漂洗去除未黏附的細(xì)胞后，逐次使用ALP活性測(cè)定試劑盒測(cè)定ALP的活性。使用酶標(biāo)儀在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A值，利用表格記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組的光吸收值，以間接檢測(cè)向成骨細(xì)胞方向分化的細(xì)胞活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BMSCs在同種異體骨內(nèi)的增殖情況

MTT比色試驗(yàn)結(jié)果顯示：BMSCs在各組同種異體骨微孔表面的生長(zhǎng)曲線呈拋物線樣，從第3天至第17天，細(xì)胞數(shù)量一直持續(xù)上升，到第11天左右進(jìn)入平臺(tái)期，增速開始減慢。100 mg/mL組、30 mg/mL組、1 mg/mL組、0.1 mg/mL組和0.025 mg/mL組的細(xì)胞數(shù)量較多，增殖速度快，但各組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而0.01 mg/mL組和空白對(duì)照組的BMSCs增殖相對(duì)較慢，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)量均少于其余各組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 BMSCs在同種異體骨微孔表面的增殖情況

2.2 細(xì)胞表達(dá)ALP的活性比較

BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)、培養(yǎng)后，從第3天至第17天，各組表達(dá)ALP的活性持續(xù)增加，至第11天左右進(jìn)入平臺(tái)期，活性增速減慢，呈拋物線樣。100 mg/mL組、30 mg/mL組、1 mg/mL組、0.1 mg/mL組和0.025 mg/mL組表達(dá)ALP的活性較高，但各組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而0.01 mg/mL組和空白對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)ALP的活性較低，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的值均小于其他各組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 BMSCs表達(dá)ALP的活性比較

3 討論

在組織工程研究中，為提高組織工程骨對(duì)細(xì)胞的親和力，優(yōu)化骨傳導(dǎo)能力，常常對(duì)其微孔表面進(jìn)行改性[9-10]。然而，臨床上所使用的同種異體骨在很多病例中難以修復(fù)骨缺損區(qū)，并且長(zhǎng)期不被吸收[11-12]。其中，同種異體骨對(duì)細(xì)胞的親和力不足是重要因素[13]，這與其未經(jīng)過(guò)表面改性，骨傳導(dǎo)能力未得到優(yōu)化有關(guān)[14-15]。

載玻片表面覆蓋多聚賴氨酸后，其細(xì)胞黏附力明顯增強(qiáng)，組織切片不易脫落[16-17]。受此啟發(fā)，本課題組在前期研究中使用多聚賴氨酸對(duì)同種異體骨進(jìn)行表面改性，發(fā)現(xiàn)表面改性后的同種異體骨對(duì)細(xì)胞的親和力顯著增加，即骨傳導(dǎo)性得到明顯提高[5-7]。此外，也有學(xué)者使用多聚賴氨酸對(duì)其他人工骨進(jìn)行表面改性，并取得了良好的結(jié)果[18-19]。有研究報(bào)道多聚賴氨酸具有細(xì)胞毒性，可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的特性，本課題組通過(guò)探索多聚賴氨酸溶液用于同種異體骨表面改性的最佳濃度，以期既能將細(xì)胞毒性控制在最低，又能發(fā)揮其最佳作用。

本課題組在著手研究之前，查閱了相關(guān)文獻(xiàn)，并參照玻片包被方法所使用的多聚賴氨酸溶液的濃度[17,20-21]，最終選擇濃度為100 mg/mL、30 mg/mL、1 mg/mL、0.1 mg/mL、0.025 mg/mL和0.01 mg/mL的多聚賴氨酸溶液分別對(duì)兔同種異體骨進(jìn)行表面改性。MTT比色試驗(yàn)和細(xì)胞表達(dá)ALP活性的結(jié)果顯示，經(jīng)100 mg/mL、30 mg/mL、1 mg/mL、0.1 mg/mL和0.025 mg/mL多聚賴氨酸溶液表面改性后的同種異體骨微孔表面的細(xì)胞親和力均得到顯著增強(qiáng)，細(xì)胞易在其表面黏附與增殖，均顯著優(yōu)于0.01 mg/mL組和空白對(duì)照組。此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，100 mg/mL組、30 mg/mL組、1 mg/mL組、0.1 mg/mL組和 0.025 mg/mL組細(xì)胞增殖的數(shù)量及表達(dá)ALP的活性無(wú)明顯差異，提示以上濃度的多賴氨酸溶液對(duì)細(xì)胞的增殖和活力影響相似。100 mg/mL、30 mg/mL的多聚賴氨酸溶液濃度較高，但高濃度的多聚賴氨酸未影響細(xì)胞黏附、增殖和分泌等活力，由此推斷，多聚賴氨酸的細(xì)胞毒性很小，細(xì)胞相容性良好。因此，從經(jīng)濟(jì)、有效方面考慮，本研究推薦對(duì)同種異體骨進(jìn)行表面改性的多聚賴氨酸溶液最佳濃度為0.025 mg/mL。

本研究使用的多聚賴氨酸溶液濃度差異很大，呈指數(shù)級(jí)，然而，并未發(fā)現(xiàn)多聚賴氨酸具有細(xì)胞毒性、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)等現(xiàn)象。分析可能有以下原因：①多聚賴氨酸的細(xì)胞毒性并沒(méi)有其他報(bào)道所稱的那么大，其細(xì)胞相容性良好；②本研究的實(shí)驗(yàn)方法盡可能與臨床運(yùn)用相一致，而與所報(bào)道的方法不一致，故得出的結(jié)論亦不同[22-24]。

綜上所述，多聚賴氨酸的細(xì)胞毒性較低，利用其對(duì)同種異體骨進(jìn)行表面改性的最佳濃度為0.025 mg/mL，本研究結(jié)果為提高同種異體骨在臨床應(yīng)用中的效果提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本研究是體外實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞周圍的環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境不同，故得出的結(jié)果尚不能完全代表體內(nèi)的實(shí)際情況。擬在今后的研究中采取動(dòng)物體內(nèi)植入的方法，進(jìn)行更加深入地觀察與分析。