羅 靜，王培軍

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，上海 200065)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease， AD)隱匿發(fā)病、進(jìn)行性發(fā)展，其病理主要改變?yōu)槟X內(nèi)β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein， Aβ)沉積形成的老年色素沉著(senile pigmentation， SP)和Tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle， NFT)[1]。目前AD帶來的社會(huì)問題日趨嚴(yán)峻[2]，臨床迫切需要能夠早期診斷的檢查方法。多種成像探針現(xiàn)已問世[3-4]，其中基于Aβ的核醫(yī)學(xué)探針如11C-PiB、18F-Flutemetamol及18F-Florbetaben等已用于臨床，但因其存在電離輻射、半衰期較短及成本較高等問題，臨床推廣受限。本課題組前期成功構(gòu)建的新型靶向Aβ的KB探針為18F-Florbetaben衍生物，通過保留18F-Florbetaben主體雙苯環(huán)結(jié)構(gòu)并對其進(jìn)行修飾，獲得了可透過血腦屏障(blood brain barrier， BBB)與Aβ結(jié)合且無電離輻射的新型探針。本研究擬構(gòu)建結(jié)合KB探針、以聚乙二醇(polyethylene glycol， PEG)修飾的磁性四氧化三鐵及靶向藥物姜黃素(curcumin, Cur)的復(fù)合納米材料，通過體外實(shí)驗(yàn)觀察其用于早期診斷AD的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與動(dòng)物 KB探針[E-1-(4-(4-甲胺基-苯乙烯基-苯氧基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜庚酸-27-酸](寧波康貝生化有限公司)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基-聚乙二醇 2000(distearoyl phosphatidylethanolamine-methoxy PEG 2000， DSPE-mPEG 2000)、二硬脂?；字Ｒ掖及?PEG-氨基(distearoyl phosphatidylethanolamine-PEG-NH2， DSPE-PEG-NH2)、Cur粉末、2-嗎啉乙磺酸[2-(4-Morpholino)ethanesulfonic acid， MES]、水溶性碳二亞胺[1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydroc， EDC](南京東納生物科技有限公司)，兔源抗Aβ抗體(4G8、6E10)(Covance)，堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(Sigma Aldrich)及馬-達(dá)二氏犬腎(Madin-Darby canine kidney， MDCK)細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)等。

無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)APP/PS1雄性轉(zhuǎn)基因小鼠10只，3月齡，體質(zhì)量(25±5)g，購于南方模式生物科技股份有限公司，許可證編號(hào)：SCXK(滬)2017-0010，飼養(yǎng)于18～22℃、相對濕度60%～80%、12 h晝夜交替環(huán)境，自由采食、飲水。本研究通過院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫理編號(hào)：2019-DW-(005)號(hào)]。

1.2 構(gòu)建磁性納米材料

1.2.1 制備Fe-Cur納米顆粒 精確稱取30 mg DSPE-mPEG 2000 及10 mg DSPE-PEG-NH2固體粉末，加入2 ml氯仿超聲溶解；向上述溶液中加入3.5 mg Fe(以氯仿配制成濃度為7 mg/ml的溶液，500 μl)，超聲混勻后加入1 mg Cur粉末(以氯仿配制成濃度為2 mg/ml溶液，500 μl)，超聲混勻；移入茄形瓶中，加入3 ml去離子水，超聲混勻；將茄形瓶置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置，以70℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至氯仿完全揮發(fā)；將茄形瓶置于磁鐵上，吸附不穩(wěn)定產(chǎn)物；以針管吸取1 ml樣品，以0.22 μm濾膜過濾；最后以MES(15 mmol/L， pH 5.5)溶解。

1.2.2 制備KB修飾的Fe-Cur-KB納米材料 取KB分子(以二甲基亞砜配制成濃度50 mg/ml溶液，10 μl)加入990 μl MES(15 mmol/l，PH 5.5)中，超聲溶解，并取0.6 ml加入制備完成的Fe-Cur中，超聲分散，室溫孵育30 min；加入0.6 mg EDC(以MES配制成濃度10 mg/ml溶液，60 μl)，室溫避光過夜振蕩孵育；采用100 KD超濾管，以純水超濾2次，并濃縮至3 ml，使Fe濃度為1 mg/ml。

1.3 表征及穩(wěn)定性測試 以X線透射電子顯微鏡觀察Fe-Cur-KB磁性納米材料的形態(tài)，Nano ZS90納米激光粒度分析儀檢測其水動(dòng)力粒徑和Zeta電位；將Cur及KB分別稀釋為不同濃度(Cur：3、2、1、0.5 μg/ml；KB：33.33、6.67、3.33、1.33 μg/ml)溶液，利用紫外分光光度計(jì)測量其吸光度，繪制Cur及小分子KB的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以10%乙腈溶液進(jìn)行破乳、磁分離，之后收集上清測試載藥量。向規(guī)格為35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2 ml含血清不完全最小必需培養(yǎng)基(minimum essential medium， MEM)/F-12，隨后依次加入10、50、100、200 μl Fe-Cur-KB原液，每個(gè)濃度重復(fù)2次，每日定時(shí)觀察培養(yǎng)皿底部有無沉淀，連續(xù)觀察7日。

1.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 在MEM+10%胎牛血清培養(yǎng)基中維持MDCK細(xì)胞，待貼壁融合達(dá)80%～90%時(shí)將細(xì)胞消化、離心，加入培養(yǎng)基，稀釋成濃度5×104/ml細(xì)胞懸液，混勻后加入96孔板，每孔100 μl；次日更換新的培養(yǎng)基，并依次加入10 μl濃度分別為0.90、0.50、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01 mg/ml的Fe-Cur-KB磁性納米材料，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔作為加藥組，另取3個(gè)復(fù)孔加入10 μl培養(yǎng)基作為未加藥組；于第3日更換新的培養(yǎng)基，并加入10 μl細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8， CCK-8)溶液，于培養(yǎng)箱中穩(wěn)定30 min后，采用紫外分光光度計(jì)測量450 nm光密度(optical density, OD)，計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=(OD加藥-OD空白)/(OD未加藥-OD空白)×100%。OD加藥為加入不同濃度材料的3個(gè)復(fù)孔OD均值；OD未加藥為第2日加入10 μl培養(yǎng)基的3個(gè)復(fù)孔OD均值；OD空白為未加入任何物質(zhì)的空白3個(gè)復(fù)孔OD均值。

1.5 BBB模擬實(shí)驗(yàn) 將MDCK細(xì)胞以每孔5×104個(gè)密度接種至12孔Transwell小室膜A室，每孔補(bǔ)液至500 μl；B室僅加入1 500 μl培養(yǎng)液，次日換液(圖1)。接種后每日記錄Transwell小室內(nèi)細(xì)胞跨上皮電阻(transepithelial electrical resistance， TEER)，繪制電阻-時(shí)間曲線圖；待電阻穩(wěn)定后棄去A、B室培養(yǎng)基，并用預(yù)先加熱至37℃的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)洗滌2次，每次平衡10 min后棄去PBS，最后向A室加入500 μl培養(yǎng)基及100 μl Fe-Cur-KB作為實(shí)驗(yàn)組，并以600 μl培養(yǎng)基為對照組；B室均加入1 500 μl培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集100 μl加藥組和未加藥組B室液體，置于酶標(biāo)儀下測量OD。

圖1 Transwell小室模擬BBB實(shí)驗(yàn)示意圖

1.6 體外成像實(shí)驗(yàn) 配置不同濃度(0.90、0.50、0.20、0.10、0.05、0.01 mg/ml)Fe-Cur-KB磁性納米材料溶液，以MFG-1000體外磁場發(fā)生儀檢測其成像情況。以Siemens Magnetom Verio 3.0T MR掃描儀、頭頸線圈采集圖像，參數(shù)：TR 600 ms，TE 15 ms，層厚2 mm，F(xiàn)OV 150 mm×150 mm。

1.7 靶向結(jié)合力實(shí)驗(yàn) 飼養(yǎng)APP/PS1模型鼠至6月齡，心臟灌流后制作冠狀位腦切片，滴加兔源抗Aβ一抗(4G8、6E10)，孵育過夜；次日以堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗孵育切片2 h，抗體稀釋比均為1∶50；于暗室中以紅色堿性磷酸酶底物工作液顯色30 min，雙蒸水清洗，以吸水紙吸干表面水漬，加入100 μl Fe-Cur-KB納米溶液孵育過夜；第3日行普魯士藍(lán)染色，梯度脫水并封片后于光鏡下觀察Aβ斑塊與納米顆粒的共定位。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。以±s表示計(jì)量資料，行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，比較2組B室溶液OD值差異。以單因素方差分析比較不同處理組細(xì)胞存活率。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Fe-Cur-KB磁性納米材料 成功構(gòu)建出Fe-Cur-KB磁性納米材料，合成示意圖見圖2。Fe-Cur-KB樣品的水動(dòng)力粒徑和Zeta電位結(jié)果見表1。以溶劑蒸發(fā)法制備的磁性納米顆粒粒徑為26.93 nm，信號(hào)強(qiáng)、粒徑較為均一，聚合物分散性指數(shù)(polymer dispersity index， PDI)較小，分散性較好。Cur顆粒表面攜帶負(fù)電荷，F(xiàn)e-Cur-KB的Zeta電位約-17.3 mV(圖3)。Cur及KB的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示Cur載藥量為0.3%，小分子KB載藥量為5.7%。材料在電鏡下呈約8～10 nm球形，形態(tài)均一，呈串珠狀排列(圖4)，且穩(wěn)定性較好。

表1 Fe-Cur和Fe-Cur-KB顆粒水動(dòng)力粒徑及Zeta電位

2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 0.90、0.50、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01 mg/ml納米溶液孵育下MDCK細(xì)胞存活率分別為98.34%、101.98%、101.03%、102.44%、95.64%、106.74%、95.14%，單因素方差分析顯示組間細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.894，P>0.05)。

2.3 BBB模擬實(shí)驗(yàn) 模擬BBB實(shí)驗(yàn)第3日，TEER穩(wěn)定>400 Ω/cm2，成功構(gòu)建BBB模型(圖5)；第5日實(shí)驗(yàn)組B室液體OD值(3.11±0.02)明顯高于對照組(2.84±0.12，t=4.028，P<0.05)，納米材料可成功通過BBB。

2.4 體外成像 不同濃度Fe-Cur-KB磁性納米材料在體外磁場發(fā)生儀下的T2WI信號(hào)呈階梯狀，成像效果優(yōu)異(圖6)。

2.5 靶向結(jié)合力 通過一抗、二抗的特異性結(jié)合及攜帶紅色堿性磷酸酶的底物顯色液的顯色，Aβ斑塊呈紅色；Fe-Cur-KB磁性納米顆粒因攜帶鐵核心，普魯士藍(lán)染色后呈藍(lán)色。光鏡下可見紅色和藍(lán)色重疊，即Aβ斑塊與Fe-Cur-KB納米顆粒存在共定位，顆?？商禺愋越Y(jié)合Aβ斑塊(圖7)。

圖2 Fe-Cur-KB磁性納米材料合成示意圖 A.KB探針分子式； B.Cur分子式； C.Fe-Cur-KB結(jié)構(gòu)示意圖(紅色星為Cur，藍(lán)色圈為修飾分子KB，黃色圓為磷脂分子疏水端，黑色圓為四氧化三鐵核心顆粒)

圖3 Fe-Cur(A)和Fe-Cur-KB(B)的Zeta電位圖

圖4 透射電鏡圖示Fe-Cur-KB磁性納米粒子 A.4×105倍； B.5×105倍

圖5 TEER變化趨勢圖

圖6 不同濃度Fe-Cur-KB的體外MR成像

3 討論

目前AD發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，現(xiàn)有遺傳學(xué)、病理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)證據(jù)均有力支持“Aβ中心理論”，即Aβ生成與清除障礙失衡所致Aβ沉積是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[5]。Aβ沉積引發(fā)其他因子參與完成AD臨床或病理改變，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白Tau蛋白高度磷酸化而形成NFT，導(dǎo)致微管失去正常結(jié)構(gòu)，神經(jīng)元骨架瓦解，進(jìn)而造成突觸神經(jīng)元丟失[6-7]。

圖7 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦切片免疫組織化學(xué)染色圖(×200) (紅色為Aβ斑塊；藍(lán)色為Fe-Cur-KB納米顆粒染色)

當(dāng)前確診AD的方法僅有腦組織活檢或尸檢，以非侵入手段診斷AD則主要依賴各種量表評估認(rèn)知，但常用簡明精神狀態(tài)量表及畫鐘測試等均存在語言偏倚或評分方法未能達(dá)成共識(shí)等問題[8]。以PET為代表的核醫(yī)學(xué)技術(shù)可利用特異性結(jié)合Aβ的探針進(jìn)行成像，實(shí)現(xiàn)AD病理特征在體可視化，其關(guān)鍵在于探針上可特異性識(shí)別并結(jié)合病理標(biāo)記物的功能基團(tuán)。Aβ聚合物之間存在β折疊，具有高度共軛芳香環(huán)且結(jié)構(gòu)較為平面的1,3-硫氮雜茚和1,2-二苯乙烯可插入其中，形成能夠特異性識(shí)別并結(jié)合Aβ的功能基團(tuán)，即PET成像中顯示淀粉斑塊的核心結(jié)構(gòu)[9]。但PET空間分辨率低，無法顯示<2 mm的斑塊，難以早期診斷AD。MR空間分辨率高于PET，且無電離輻射，是早期診斷AD的理想影像學(xué)手段之一。

傳統(tǒng)MR對比劑無靶向性及特異性，且無法通過BBB。AD帶來輕微BBB破壞，但滲漏的對比劑不足以引起MRI信號(hào)變化及顯示AD病理變化。本研究采用溶劑蒸發(fā)法將Cur負(fù)載在PEG和四氧化三鐵間的脂質(zhì)環(huán)境下，使其穩(wěn)定存在于復(fù)合材料中，依賴其表面羧基和PEG化四氧化三鐵顆粒上的氨基，KB小分子通過EDC實(shí)現(xiàn)化學(xué)耦聯(lián)，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵(酰胺鍵)，由此成功構(gòu)建出安全性較好的Fe-Cur-KB磁性納米材料；與傳統(tǒng)對比劑相比，其最大優(yōu)勢在于具有通過BBB與Aβ靶向結(jié)合的能力，可在大腦中與Aβ特異性結(jié)合并形成信號(hào)差異，通過與周圍正常組織對比，即可實(shí)現(xiàn)早期診斷AD。

Cur提取自姜黃根莖，是天然黃色素，可抗感染、抗氧化、降低淀粉負(fù)荷并阻止Aβ聚集[10]。既往研究[11]顯示天然來源的Cur十分安全，即使攝入量達(dá)到4 g/d、持續(xù)半年，也未出現(xiàn)慢性不良反應(yīng)。目前對于建立AD細(xì)胞模型方法存在較大爭議，通常采用單一因素誘導(dǎo)細(xì)胞，與AD發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性不符。此外，Cur能否提高AD模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力尚需通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評估[12-13]。

總之，本研究構(gòu)建的Fe-Cur-KB磁性納米材料在體外表現(xiàn)出良好的生物相容性和穩(wěn)定性，具有透過BBB并與Aβ靶向結(jié)合及MR成像能力，有望用于MR早期診斷AD。