耿麗麗，陶嶺梅，張宏軍*，張 杰*

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125）

1 Bt概述

1.1 Bt簡介

蘇云金芽胞桿菌屬革蘭氏陽性菌，芽胞桿菌屬，是一種能引起昆蟲疾病的病原細(xì)菌。1901年，日本學(xué)者Ishiwata從猝倒死亡的家蠶體內(nèi)分離出一種桿狀細(xì)菌（即后來被確定為Bt猝倒亞種B. thuringiensis subsp.sotto，Ishiwata，1901）[1]，由于當(dāng)時的科學(xué)認(rèn)知有限，并沒有被命名。直到 1915年，德國學(xué)者 Berliner從圖林根州（Thuringia）的地中海粉螟Anagasta kuehn蟲尸中再次分離到該類細(xì)菌，被正式命名為蘇云金芽胞桿菌[2]。Bt在自然界中分布十分廣泛，存在于昆蟲、植物葉表和根際、土壤、水、倉庫粉塵等。Bt在形成芽胞的同時產(chǎn)生蛋白晶體（Insecticidal crystal protein，ICPs），包括Cry和Cyt蛋白，絕大多數(shù)屬于酸性蛋白。其被昆蟲攝入體內(nèi)后，能在昆蟲中腸的堿性環(huán)境中溶解，然后被一系列中腸蛋白酶激活，活化成一個大約為60 kDa的具有3個核心結(jié)構(gòu)域的活性蛋白（多數(shù)原蛋白大小約為130 kDa），活化蛋白首先與中腸上不同的受體相互作用，進(jìn)而發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致寡聚化的發(fā)生，這些寡聚化的蛋白插入昆蟲中腸上皮細(xì)胞，引起細(xì)胞膜穿孔，最終造成蟲體死亡[3,4]。而哺乳動物腸道等消化系統(tǒng)中無殺蟲晶體蛋白的受體，因此Bt蛋白及其產(chǎn)品對人畜等高等生物是安全的。

1.2 Bt制劑

Bt制劑自1938年起在全球已經(jīng)成功使用80余年，應(yīng)用范圍主要為糧食作物、蔬菜、瓜果和林木，成為生產(chǎn)有機食品的重要選擇和保障，是目前世界上產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲劑。Bt殺蟲劑的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)經(jīng)歷了3個階段：第一階段利用自然菌株，1938年，第一個商品制劑Sporeine在法國問世。1958年，美國第一個商品Thuricide投入市場，經(jīng)FDA批準(zhǔn)，允許在20多種作物上防治23種害蟲。第二階段：進(jìn)入80年代，以質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移和質(zhì)粒消除方法而產(chǎn)生的第二代Bt產(chǎn)品，如Ecogen公司的Foil等產(chǎn)品。第三階段：1989年之后，Bt工程菌得到迅猛的發(fā)展。通過基因工程方法構(gòu)建的第三代Bt問世，如美國公司構(gòu)建的工程菌株Agree和Condor等產(chǎn)品，這些產(chǎn)品分別在產(chǎn)品持效期、毒力、殺蟲譜等菌株特性方面取得了很大提高。1991年，美國第一個轉(zhuǎn)Bt cry1Ac基因的熒光假單胞工程菌MVP批準(zhǔn)商業(yè)化應(yīng)用；1995年，Ecogen公司創(chuàng)制的Raven產(chǎn)品（導(dǎo)入了cry3Bb基因）獲得FDA批準(zhǔn)，是第一個商業(yè)化應(yīng)用的Bt基因工程菌。該類植物用轉(zhuǎn)基因Bt工程菌主要用于食用作物的害蟲防治，在美國已有30年使用的歷史，目前無一例引起人畜過敏、中毒、危害健康的報道。

Bt制劑在中國已有50余年的應(yīng)用歷史。我國學(xué)者篩選、收集和保存了大量天然菌株，通過優(yōu)化篩選已得到對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等害蟲具有良好毒效的菌株；在國家“863”、“973”等項目的支持下，我國Bt產(chǎn)品的研發(fā)進(jìn)入第三代，通過射線誘變、分子誘變或基因重組等方法，在提高Bt菌劑的毒效、擴大殺蟲譜、提高產(chǎn)物收率、降低生產(chǎn)成本等方面取得了重大進(jìn)展，使我國在開發(fā)、研制、生產(chǎn)和使用Bt殺蟲劑領(lǐng)域達(dá)到國際領(lǐng)先水平，產(chǎn)品已批量出口美、歐、東南亞等國家或地區(qū)。

1.3 轉(zhuǎn)Bt基因作物

20世紀(jì)90年代中期，第一批商業(yè)化的抗蟲轉(zhuǎn)基因作物主要是玉米、土豆和棉花。早期商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物，只含有一個Bt基因。隨著Bt基因的克隆，其他對鱗翅目害蟲有活性的蛋白，如Cry1F、Cry2Ab2也陸續(xù)被應(yīng)用，并開始應(yīng)用兩種Bt基因的組合。隨后，商業(yè)化的玉米品種多采用多基因策略，同時抗鱗翅目和鞘翅目的害蟲，而且，先正達(dá)首次使用了非晶體蛋白Vip3。2009年，孟山都公司研發(fā)的轉(zhuǎn)基因玉米品種中同時含有6個Bt基因，其中Cry34Ab1、Cry35Ab1和Cry3Bb1主要用來防治玉米根蟲，Cry1A.105、Cry2Ab2和Cry1F防治玉米螟、草地貪葉蛾和小地老虎。2010年，在美國和加拿大批準(zhǔn)商業(yè)化種植的SmartStax玉米含有8個外源基因，同時抗地上、地下害蟲并具有草甘膦和草銨膦耐藥性。2018年，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)到1.917億公頃，其中復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物的種植面積已經(jīng)達(dá)到8278萬公頃，這些復(fù)合性狀作物中大部分至少含有一種Bt基因[5]。

2 Bt登記情況

2.1 美國登記情況

美國環(huán)保署（EPA）設(shè)立了專門負(fù)責(zé)生物農(nóng)藥登記管理的部門，并于1984年公布了《生物農(nóng)藥注冊指南》，是世界上登記生物農(nóng)藥品種較多的國家之一。在其現(xiàn)行的生物農(nóng)藥登記資料規(guī)定中，將生物農(nóng)藥分為生物化學(xué)農(nóng)藥、微生物農(nóng)藥及轉(zhuǎn)基因植物等3大類[6]。美國工程菌審批將Bt基因工程菌歸為殺蟲劑的一種，審批流程與野生 Bt菌大體相同，申請流程相對簡單，獲得登記后即可上市。工程菌登記時提供材料和數(shù)據(jù)與野生菌相同，根據(jù)工程菌采用遺傳操作技術(shù)的不同，要求申請者提供額外的數(shù)據(jù)（http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides/regtools/biotech-reg-prod.htm）。在進(jìn)行小規(guī)模田間試驗前，要向美國環(huán)保署提出申請，由EPA決定是否需要“Experimental Use Permit（實驗用許可）”。當(dāng)試驗規(guī)模超過10英畝，必須先獲得“Experimental Use Permit（實驗用許可）”。國外生物農(nóng)藥審批的核心理念是“低風(fēng)險”，而不是“零風(fēng)險”。

這么多的 Bt制劑投入生產(chǎn)應(yīng)用，與美國環(huán)保局對生物農(nóng)藥的推動密不可分。生物農(nóng)藥商業(yè)化生產(chǎn)在美國獲得批準(zhǔn)所要提供的資料數(shù)據(jù)比傳統(tǒng)農(nóng)藥要少，并且審批程序會在一年內(nèi)完成，而傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥批準(zhǔn)周期平均都要在3年以上[7]（http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides/whatare biopesticides.htm）。最近十年來，由于轉(zhuǎn)Bt基因玉米、棉花等的沖擊，美國用于防治玉米、棉花等作物害蟲的Bt工程菌申請的數(shù)量偏少，但在申請和獲得批準(zhǔn)用于衛(wèi)生害蟲蚊子和其他農(nóng)林害蟲防治的 Bt及其工程菌產(chǎn)品增加，其中有些產(chǎn)品可以用于食用作物（表1）。

表1 美國環(huán)境保護(hù)局批準(zhǔn)的Bt殺蟲劑（2010—2018年）Table 1 BT insecticide approved by US environmental protection agency (2010—2018)

2.2 我國登記情況

農(nóng)業(yè)部2017年的2569號公告《農(nóng)藥登記資料要求》中對微生物農(nóng)藥做了明確定義，是指以細(xì)菌、真菌、病毒和原生動物或基因修飾的微生物等活體為有效成分的農(nóng)藥。Bt制劑屬于微生物農(nóng)藥，截至 2020年8月，登記產(chǎn)品數(shù)量達(dá)到240個（中國農(nóng)藥信息網(wǎng)http://www.chinapesticide.org.cn/）。目前，80%以上登記的劑型還是可濕性粉劑（WP）和懸浮劑（SC）。但是Bt SC制劑穩(wěn)定性較差，在國外一般使用冷鏈運輸和低溫保存，這大大增加了使用成本。

2018年中興通訊危機催生了關(guān)于“中國芯”的全民焦慮，引起了國人的深刻反省，深感“核心技術(shù)”對于國家發(fā)展的重要性，而要避免“受制于人”則要有自己的核心技術(shù)。這一事件暴露了我國在某些關(guān)鍵科技領(lǐng)域存在的不足，同時也更加堅定了我國要大力發(fā)展科學(xué)技術(shù)，形成自己核心競爭力的信念。科技創(chuàng)新政策在促進(jìn)科技進(jìn)步，推動科技創(chuàng)新方面發(fā)揮著重要的激勵與引導(dǎo)作用。這就需要我國在科技創(chuàng)新政策方面加大支持力度，構(gòu)建協(xié)調(diào)順暢的科技創(chuàng)新激勵機制，從而促進(jìn)我國的科學(xué)技術(shù)快速進(jìn)步。

我國一直高度重視生物農(nóng)藥研發(fā)與應(yīng)用，尤其是微生物農(nóng)藥的發(fā)展，通過廣泛征求意見，在科學(xué)、合理的基礎(chǔ)上盡量降低登記資料的門檻。而我國 Bt基因工程菌要實現(xiàn)商業(yè)化，在進(jìn)行農(nóng)藥登記前，還需要進(jìn)行農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價，并獲得轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)應(yīng)用安全證書。國務(wù)院早在 2002年我國就出臺了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》，明確了植物用轉(zhuǎn)基因微生物安全評價的內(nèi)容，主要涉及環(huán)境安全性評價，并將安全性評價分為四個階段：中間試驗、環(huán)境釋放、生產(chǎn)性試驗和生產(chǎn)應(yīng)用安全證書的申請。在每個階段都有相應(yīng)的監(jiān)督和管理要求，要求試驗必須在封閉的條件下實施，中間試驗是根據(jù)安全性評價的要求提出具體試驗設(shè)計，向農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和相關(guān)省市、自治區(qū)備案，而后面3個環(huán)節(jié)需向農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提交申請，通過審核方可實施或獲得安全證書。

3 Bt產(chǎn)品的安全性

3.1 對Bt產(chǎn)品的毒性/致病性評價

早在20世紀(jì)70～80年代我國學(xué)者、生產(chǎn)企業(yè)開展了Bt制劑對哺乳動物、家禽的急性、亞急性和慢性毒性試驗，對其安全性進(jìn)行了較系統(tǒng)的評價[8]。研究表明，Bt7216菌劑、Bti菌粉和孑孓靈制劑（Bt以色列亞種，血清型H14）對小白鼠、豚鼠、豬和家禽等試驗動物無急性毒性，試驗動物內(nèi)臟組織病理切片無病變；亞急性毒性試驗的結(jié)果顯示，孑孓靈制劑對妊娠母豬、魚的親本和子一代的生長發(fā)育均無影響；對獼猴口服Bti菌劑的慢性毒性試驗結(jié)果表明，獼猴無異常表現(xiàn)，反應(yīng)靈敏，體質(zhì)量增加，血常規(guī)檢查正常。劉志勇等[9]按照《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗方法》（GB15670-1995），對一種 Bt原藥進(jìn)行急性經(jīng)口、經(jīng)皮、吸入毒性試驗、眼睛刺激試驗和致敏試驗，發(fā)現(xiàn)該 Bt原藥急性經(jīng)口和吸入屬微毒性、急性經(jīng)皮屬低毒性、眼睛刺激試驗為無刺激性，致敏試驗屬I級弱致敏物。高效滅蚊蚴菌株Bt以色列變種187對哺乳動物進(jìn)行的急性和亞急性毒性試驗結(jié)果表明，該菌株對哺乳動物無毒性、感染性和致病性[10,11]，且該菌株對魚類（青魚、柳條魚）和水生動物米蝦也是安全的[12]。濃度為108CFU/mL的菌株BtZ01對小鼠胚胎發(fā)育及胚后各階段體質(zhì)量和體長等生長發(fā)育指標(biāo)無不良影響[13]。即使給小鼠飼喂高劑量Cry1Ab/Ac蛋白（5 g/kg體質(zhì)量），該蛋白在胃液和腸液中迅速降解，對小鼠的生長發(fā)育沒有任何不良影響[14]。南通通大化學(xué)物安全性評價中心及天津市疾病預(yù)防控制中心對Bt基因工程菌G033A[15]進(jìn)行了急性經(jīng)口、經(jīng)皮、吸入、皮膚刺激、眼刺激、皮膚致敏性試驗及急性經(jīng)口、經(jīng)肺、腹腔注射的毒性/致病性試驗，受試動物均未出現(xiàn)中毒、過敏和致病反應(yīng)[16]。Bt以色列亞種SH-14經(jīng)口和吸入對受試小鼠都為微毒性級別[17]。一個雜合的Cry1A.105蛋白，核心區(qū)的3個結(jié)構(gòu)域分別來自Cry1Ab、Cry1Ac和Cry1F蛋白，以2451 mg/kg的劑量飼喂小鼠，未見異常反應(yīng)[18]。

2016年，歐洲食品安全局（European Food and Safety Authority，EFSA）提出，Bt可能與蠟狀芽胞桿菌B. cereus相同，存在導(dǎo)致腹瀉的風(fēng)險[19]。但隨后Raymond等[20]駁斥了EFSA的提法，指出了EFSA引用文獻(xiàn)的漏洞，并列舉了一系列數(shù)據(jù)和文章，證明Bt菌株是目前最安全、應(yīng)用最成功的生物農(nóng)藥。EFSA對Bt引起腹瀉風(fēng)險的結(jié)論源于一起蔬菜沙拉導(dǎo)致的腹瀉事故，從食物中分離到低濃度的Bt菌株（3×104CFU/g），但患者的糞便中并未發(fā)現(xiàn)Bt菌株的增殖，沒有直接的證據(jù)表明是由Bt菌株導(dǎo)致了腹瀉。從1961年到1995年，在美國EPA共登記了177種以Bt菌株或Cry蛋白作為活性成分的產(chǎn)品，都測試了其對哺乳動物的致病性。這些研究表明，Bt及其產(chǎn)品（劑量低于108CFU/只鼠，相當(dāng)于1011CFU/人）對哺乳動物無致病性和毒性[21]。高劑量可能造成對哺乳動物的危害，但要一次吃10噸的蔬菜沙拉，才有可能導(dǎo)致副作用的產(chǎn)生[20]。目前，沒有報道表明高劑量口服Bt會引起感染或其他癥狀[21]：給老鼠每天飼喂109CFU劑量連續(xù)730 d（相當(dāng)于老鼠一生都在食用高劑量Bt），老鼠生長發(fā)育正常，并未出現(xiàn)任何病癥；即使提高到1012CFU劑量，也沒有對羊和老鼠產(chǎn)生影響；志愿者口服1 g Bt制劑（Thuricide產(chǎn)品，相當(dāng)于1011CFU）5 d，無不良影響。另外，Bt制劑在新西蘭的奧克蘭和英國的維多利亞等城市的大面積使用，與其他未使用城市相比，并未引起市民的健康問題[20]。

3.2 Bt產(chǎn)品對環(huán)境的影響

West等[22]發(fā)現(xiàn)Bt數(shù)量在土壤中呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢，土壤中養(yǎng)分和pH可能是影響其生存和生長最關(guān)鍵因素。田間條件下，Bt施用兩周后，土壤中芽胞數(shù)量即減少一個數(shù)量級[23]。Bt蠟螟亞種菌株施用于黏土環(huán)境，4個月后，芽胞數(shù)減少了76%，對靶標(biāo)害蟲的毒性幾乎沒有，說明晶體蛋白降解速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過芽胞[24]。Bt蛋白在黃褐土、紅壤、磚紅壤、潮土等土壤中，兩周即檢測不到[25]。田間條件下，噴灑 Bt菌株于棉花和甘藍(lán)葉面上，1 d后芽胞失活率分別為 78.1%和 68.4%，3 d后芽胞失活率分別為 99%和87.2%，且芽胞的失活主要由于白天陽光中的紫外線[26]。對植物葉片分別噴灑不同濃度的Bt制劑（109和1011CFU/mL），15 d后，Bt的濃度都為103CFU/g葉片[27]。

經(jīng)過多年的田間監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，Bt基因工程菌G033A在土壤中可以殘留一年左右，但種群數(shù)量總體上呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢，從最初的約104CFU /g干土降低到約101CFU /g干土或者完全消失；由于采用的施藥方法為葉面噴施，前期工程菌G033A主要殘留在葉面上，葉面上工程菌的數(shù)量最高可達(dá)105CFU /cm2；兩周后，由于紫外線的照射、降水等作用，葉片表面工程菌的數(shù)量迅速減少，約為101CFU/cm2，3個月后，由于田間濕度降低，紫外線照射增強等多種因素影響，基本檢測不到工程菌的存在；經(jīng)過多年的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)G033A只能擴散到20 m以內(nèi)的區(qū)域，隨著距離的增加，能檢測到工程菌的數(shù)量逐步下降，在隔離區(qū)外（20 m以外），無論在植物葉片還是土壤中都沒有檢測到工程菌的存在[16]。

3.3 Bt產(chǎn)品對生態(tài)安全的影響

3.3.1 對非靶標(biāo)生物的影響 Bt制劑對多種重要的農(nóng)林及衛(wèi)生害蟲具有特異的殺蟲活性，但是他們對非靶標(biāo)生物是否會產(chǎn)生直接或間接影響？澳大利亞紐發(fā)姆有限公司的Bt制劑XenTari?田間施用沒有影響捕食性和寄生性天敵的數(shù)量，對飛虱、葉蟬的種群規(guī)模也無顯著影響[28]。Stefan等[30]通過分析連續(xù)3年田間試驗的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)基因玉米相比，轉(zhuǎn)Bt玉米MON88017對非靶標(biāo)葉蟬的種群密度影響不顯著[29]。也有研究表明Bt產(chǎn)品Dipel田間噴灑對非靶標(biāo)昆蟲禾谷縊管蚜Rhopalosiphum padi的生長發(fā)育及種群密度無影響，但捕食者草蛉Chrysoperla carnea的發(fā)育歷期延長。但后續(xù)也有研究對該結(jié)果提出了質(zhì)疑，蚜蟲屬于刺吸式害蟲，用刺吸式口器吸食植物組織汁液，取食到 Bt制劑的機會較小，研究發(fā)現(xiàn)即使直接飼喂Cry1Ab蛋白對草蛉的生長發(fā)育也無負(fù)面影響[31]。在噴灑基因工程菌G033A的田塊和對照田塊分別調(diào)查田間主要節(jié)肢動物的種類和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)武漢市東西湖區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗基地田間主要的非靶標(biāo)昆蟲種類為粉虱、蚜蟲、薊馬、美洲斑潛蠅、草蛉、蜘蛛、螞蟻等，新疆烏魯木齊縣永豐鄉(xiāng)永勝村主要的非靶標(biāo)節(jié)肢動物種類為瓢蟲類、蜘蛛類、蝽類等。研究結(jié)果表明工程菌 G033A對這些節(jié)肢動物種群動態(tài)影響不顯著，有益昆蟲和天敵的種群數(shù)量略有增加[16,32]。

由于 Bt制劑在田間的使用，可能導(dǎo)致一些有益昆蟲，如蜜蜂、家蠶有暴露機會。家蠶是我國的重要經(jīng)濟昆蟲，Bt制劑及產(chǎn)品對其影響也受到人們的關(guān)注。家蠶屬于鱗翅目昆蟲，中腸可能存在Bt蛋白的受體，已有報道某些殺蟲晶體蛋白，如Cry1Aa、Cry1Ai、Cry1F、Cry2A對家蠶有殺蟲活性[33-35]。108CFU/mL的 Bt原藥對家蠶的結(jié)繭率和死亡率均具有顯著影響，但對產(chǎn)繭能力指標(biāo)無顯著性影響[36]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)家蠶原種對Bt產(chǎn)品較為敏感，而雜交種的生存等則不受影響[37]。為了避免Bt產(chǎn)品對蠶作生產(chǎn)安全的影響，研究者通過對殺蟲晶體蛋白的改造，使其保留對靶標(biāo)害蟲的活性，但喪失了對家蠶的活性[42]。因此，Bt產(chǎn)品對家蠶的影響要采取個案分析的原則，并明確標(biāo)識，建議在家蠶的原種場周圍要特別慎用Bt產(chǎn)品。蜜蜂是一種關(guān)鍵的非靶標(biāo)有益生物，是多種農(nóng)作物的傳粉者，在生態(tài)和經(jīng)濟中扮演著非常重要的角色。Babendreier等[38]用含Cry1Ab毒素的糖水（濃度0.0014%）飼喂意大利蜜蜂10 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不會對蜜蜂咽下腺的發(fā)育造成不良影響。將濃度為20 μg/mL的Cry1Ac蛋白飼喂3日齡的蜜蜂幼蟲及成蟲，對其存活率無顯著影響[39]。給蜜蜂飼喂劑量為625 μg/g的Cry1Ba蛋白，對其飛行能力和壽命沒有顯著的影響[40]。田巖等[41]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn) cry1Ab基因抗蟲玉米花粉對意大利蜜蜂蛹的生長發(fā)育和體內(nèi)酶活性無顯著影響。Babendreier等[42,43]研究Bt殺蟲晶體蛋白不會對蜜蜂腸道細(xì)菌群落產(chǎn)生顯著影響，室內(nèi)飼喂和田間試驗均表明轉(zhuǎn)cry1Ah基因玉米花粉對中華蜜蜂Apis cerarta cerac腸道微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著影響[44,45]。當(dāng)瓢蟲Cheilomenes sexmaculatus以飼喂Cry1Ab或Cry1Ac蛋白的豆蚜Aphis craccivora Koch為食時，對其生長發(fā)育無負(fù)面影響[46]。用轉(zhuǎn)cry3Bb基因玉米的花粉室內(nèi)持續(xù)飼喂瓢蟲Coleomegilla maculata幼蟲和成蟲，對幼蟲的化蛹和成熟無顯著影響，同時對成蟲的生存和繁殖都沒有不利的影響[47]。

3.3.2 對土壤微生物群落的影響 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，在整個農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中起著非常重要的作用，因此，監(jiān)測田間噴灑Bt制劑后對土壤微生物的影響至關(guān)重要。有學(xué)者測試了多種Bt菌株（包括庫斯塔克亞種、以色列亞種和莫里遜亞種）對多種細(xì)菌、真菌的生長無影響[48]。武漢天惠生物工程有限公司生產(chǎn)的Bt制劑（農(nóng)藥登記證號: PD20091472），使用推劑量（0.1 kg/hm2）和超高劑量（10 kg/hm2），對蘇棉12的根際微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著影響[49]。Bt CH菌株制劑噴灑于果園土壤后，土壤中芽胞桿菌屬的消長動態(tài)沒有明顯的影響[50]。Cry1Ac蛋白以100 ng/g的劑量添加到土壤中，沒有影響土壤中微生物的多樣性和均勻性，且土壤中主要的細(xì)菌、真菌在3個月內(nèi)無顯著變化[51]。Bt玉米34B24田間種植對土壤中細(xì)菌和真菌根際微生物群落組成無顯著影響[52]。實驗室條件淹水土壤中添加克螟稻秸桿對微生物群落無長期顯著的負(fù)面影響，但秸桿處理土壤中可培養(yǎng)厭氧性細(xì)菌數(shù)量等均與未處理對照存在顯著差異[53]。

叢枝菌根真菌Arbuscular mycorrhizal利于提高植物抗御不良環(huán)境的能力，促進(jìn)植物生長，土壤中接種Bt菌株增加了萵苣Lactuca sativa L. cv. Romana叢枝菌根真菌的根外菌絲和根內(nèi)菌絲的定殖能力[54]。干旱條件下，同時接種 Bt和叢枝菌根真菌減少了干旱對脂質(zhì)的氧化損傷和脯氨酸的積累，可降低干旱對作物的損傷[55]。

4 Bt產(chǎn)品的公眾輿情

民眾對于Bt產(chǎn)品的關(guān)注，集中于Bt蛋白和轉(zhuǎn)Bt基因作物，尤其以后者為主。近兩年來，Bt產(chǎn)品的輿情較為平穩(wěn)，博客、微博和微信等自媒體不再被反轉(zhuǎn)謠言所占領(lǐng)。主要得益于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部加強了對轉(zhuǎn)基因作物的科普宣傳：（1）利用網(wǎng)絡(luò)平臺，如“農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因管理”、“轉(zhuǎn)基因?qū)υ挕?、“轉(zhuǎn)基因微問答”等微信公眾號；（2）建立了完善的信息公開平臺，在不涉及個人及國家秘密的前提下，最大限度地公開Bt產(chǎn)品的相關(guān)信息；（3）設(shè)立了輿情監(jiān)測平臺，邀請一批相關(guān)領(lǐng)域的專家加入科普行列，撰寫科普文章[56]。

5 Bt產(chǎn)品的局限性

雖然Bt產(chǎn)品與化學(xué)農(nóng)藥相比具有高度的特異性、綠色無毒等優(yōu)點，但也存在如下的局限性：

（1）產(chǎn)品種類少而防治對象較為單一。對鞘翅目葉甲科害蟲目前只有一個登記產(chǎn)品，對地下害蟲、突發(fā)性害蟲草地貪夜蛾等都沒有登記的產(chǎn)品。

（2）劑型種類有限。目前的 Bt產(chǎn)品多為可濕性粉劑多，顆粒劑、油懸浮劑少，適用于新型無人機等輕簡化器械的劑型跟不上市場需求，缺乏適用于土壤環(huán)境的防治地下害蟲的緩釋劑型。

（3）與化學(xué)農(nóng)藥相比，速效性較差。使用效果受環(huán)境影響大，Bt制劑在田間施用后，具有殺蟲活性的晶體蛋白在高溫或太陽強紫外照射下容易失活，影響了產(chǎn)品性能的充分發(fā)揮。

（4）存在一定水平的抗性。同化學(xué)農(nóng)藥一樣，由于Bt制劑的廣泛應(yīng)用和轉(zhuǎn)Bt基因作物的大面積種植，害蟲在持續(xù)的選擇壓力下，可能會產(chǎn)生抗性[57]。最早報道的田間對 Bt產(chǎn)品產(chǎn)生抗性是在 20世紀(jì)90年代，大田中的小菜蛾P(guān)lutella xylostella對Bt制劑Dipel產(chǎn)生了抗性[58]，在我國的廣州、武漢等地也發(fā)現(xiàn)了小菜蛾對該產(chǎn)品產(chǎn)生抗性[59]；隨后，發(fā)現(xiàn)美洲棉鈴蟲Helicoverpa zea對轉(zhuǎn)cry1Ac基因棉花產(chǎn)生了抗性[60]。

（5）Bt殺蟲劑市場有待規(guī)范。由于國家大力提倡和鼓勵發(fā)展生物農(nóng)藥，提供綠色通道和補貼，一些企業(yè)在 Bt產(chǎn)品中違法添加氯蟲苯甲酰胺、氟蟲腈、高效氯氰菊酯、啶蟲脒等隱性成分[61]，以獲得更高的收益。2017、2018年全國生物農(nóng)藥的市場抽查情況，合格率分別是 40%和 54%。現(xiàn)在通過二維碼的實施和市場抽查力度的加強，這種現(xiàn)象正在改善，需進(jìn)一步加大市場監(jiān)控和違規(guī)添加其他農(nóng)藥的懲罰力度，以保證Bt等生物農(nóng)藥健康發(fā)展和良性市場競爭。另外，Bt殺蟲劑準(zhǔn)入門檻較低，沒有生物農(nóng)藥藥效統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)品，且檢測標(biāo)準(zhǔn)尚未與國際接軌，導(dǎo)致仿制、假冒偽劣產(chǎn)品多，不僅損害了真正具有研發(fā)能力廠家的利益，更為重要的是對環(huán)境、對消費者帶來諸多負(fù)面影響。

（6）Bt產(chǎn)品活力單位尚不明確。當(dāng)前普遍使用的活力單位是IU/mg（每mg多少個國際單位），不能準(zhǔn)確反映有效的殺蟲蛋白主要成分。由于保存不當(dāng)導(dǎo)致生產(chǎn)菌株變異的情況較為普遍，缺乏先進(jìn)的分子鑒定手段，對不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量影響較大。

6 幾點建議

針對上述Bt產(chǎn)品應(yīng)用中存在的局限性，相關(guān)研發(fā)單位或部門應(yīng)共同努力，加強科技攻關(guān)和市場監(jiān)管，營造健康的市場環(huán)境。

6.1 研發(fā)方面

（1）針對我國重要農(nóng)林害蟲，建立高效的Bt菌株資源挖掘體系，加快新的功能性Bt菌株篩選與產(chǎn)業(yè)化，如選育防線蟲Bt、防韭蛆Bt、防草地貪夜蛾Bt、防金龜子Bt，構(gòu)建同時抗多種害蟲的Bt復(fù)合功能工程菌株，擴大Bt的應(yīng)用；（2）通過Bt新劑型，如水分散粒劑（WDG）、干懸浮劑（DF）、油懸浮劑（OD）的研究與改進(jìn)，加快Bt產(chǎn)品與輕簡化種植管理技術(shù)的結(jié)合；（3）在劑型中加入紫外線掩蔽劑，抗光分解，提高產(chǎn)品效果與產(chǎn)品穩(wěn)定性；同時構(gòu)建可阻止母細(xì)胞裂解，但不影響芽胞和晶體產(chǎn)量的 Bt基因工程菌，增加產(chǎn)品的持效性；（4）篩選具有不同基因型的高效殺蟲菌株，避免長期使用單一Bt制劑，并采用與其他生物農(nóng)藥科學(xué)復(fù)配的綜合防治策略，以延緩抗性的產(chǎn)生；同時深入研究害蟲產(chǎn)生抗性的生化和遺傳基礎(chǔ)，便于制定合理的抗性防治措施，保障Bt制劑的可持續(xù)利用。

6.2 管理方面

（1）產(chǎn)品登記應(yīng)提供菌株保藏號和全基因組序列，全基因組序列測定可以準(zhǔn)確的區(qū)分同一菌種的不同菌株，其與同種標(biāo)準(zhǔn)基因組之間所存在差異的描述可有效防止產(chǎn)品仿制；（2）建立嚴(yán)格高效的質(zhì)量監(jiān)督體系，通過建立與國際接軌的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范產(chǎn)品質(zhì)量與應(yīng)用方法，提高產(chǎn)品監(jiān)管能力。建議 Bt產(chǎn)品標(biāo)識晶體蛋白含量，既有利于產(chǎn)品監(jiān)管，也有利于企業(yè)實現(xiàn)自身產(chǎn)品的質(zhì)量控制；（3）規(guī)范Bt殺蟲劑市場。由于國家大力提倡和鼓勵發(fā)展生物農(nóng)藥，提供綠色通道和補貼，一些企業(yè)在 Bt產(chǎn)品中違法添加氯蟲苯甲酰胺、氟蟲腈、高效氯氰菊酯、啶蟲脒等隱性成分[59]，以獲得更高的收益。2017、2018年全國生物農(nóng)藥的市場抽查情況，合格率分別是40%和54%?，F(xiàn)在通過二維碼的實施和市場抽查力度的加強，這種現(xiàn)象正在改善，需進(jìn)一步加大市場監(jiān)控和違規(guī)添加其他農(nóng)藥的懲罰力度，以保證 Bt等生物農(nóng)藥健康發(fā)展和良性市場競爭；（4）規(guī)范對“綠色農(nóng)產(chǎn)品”田間認(rèn)證、綠色優(yōu)價機制，提高“綠色農(nóng)產(chǎn)品”的收購價格，實現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品的“優(yōu)質(zhì)優(yōu)價”，從源頭上形成推動農(nóng)戶主動選用生物農(nóng)藥的內(nèi)動力；（5）加強試驗示范，在各省市建立Bt示范點，通過科學(xué)示范，引導(dǎo)更多用戶自覺使用Bt產(chǎn)品。

公眾對健康和生態(tài)安全的關(guān)注顯著增加，而生物農(nóng)藥是生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)者，也是保證農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要優(yōu)質(zhì)農(nóng)資。Bt產(chǎn)品與化學(xué)殺蟲劑相比，具有低毒、環(huán)境友好等特點，將為有效減少化學(xué)農(nóng)藥使用、減少有毒物質(zhì)殘留和保證農(nóng)產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)安全提供技術(shù)支撐。通過產(chǎn)學(xué)研的有效結(jié)合，加大 Bt產(chǎn)品的研發(fā)力度，將切實推進(jìn)Bt及生物農(nóng)藥發(fā)展和生態(tài)文明建設(shè)。