王旭洋,郭麗雙,張鵬霞,李 紅,馬 微

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓細(xì)胞白血病M3型，約占急性髓系白血病的10%，在青年人惡性腫瘤中的發(fā)病率居于前列[1-2]。由于供體源、技術(shù)及經(jīng)濟(jì)等因素的限制，骨髓移植難以推廣，目前藥物治療仍然在白血病治療中占據(jù)不可替代的作用。此外，隨著基因的多變及耐藥性的出現(xiàn)，APL發(fā)病機(jī)制的不斷深入研究，新藥的研發(fā)對(duì)于提高APL的治療效果具有重要意義。

齊墩果酸(Oleanolic Acid，OA)又名慶四素，為五環(huán)三萜類化合物，是從數(shù)種食品和藥用植物中分離出來的一種天然產(chǎn)物。齊墩果酸在不同的體外和體內(nèi)模型中具有抗腫瘤和癌癥生長(zhǎng)的作用[3]，如抑制多藥耐藥性肝癌的癌細(xì)胞生長(zhǎng)[4]，抑制胃癌細(xì)胞的有氧糖酵解及增殖[5]，抑制前列腺癌細(xì)胞中p-AKTser473蛋白表達(dá)[6]等。在HL-60中，Paszel-Jaworska等人在實(shí)驗(yàn)中報(bào)告了OA能夠抑制HL-60細(xì)胞增殖活性并促進(jìn)其凋亡[7]，本課題組也在早期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)OA能降低HL-60細(xì)胞中PI3K、AKT的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證OA對(duì)HL-60的作用，并探討其發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料主要實(shí)驗(yàn)試劑：OA(美國(guó)Sigma公司)，Annexin V：FITC Apoptosis Detection Kit II(美國(guó)BD公司)，β-actin一抗(美國(guó)Santa公司)，PI3K110α、P-AKT(Ser473)、P-AKT(Thr308)、AKT、Anti-Rabbit、Anti-mouse一抗等(美國(guó)CST公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)公司)。主要實(shí)驗(yàn)儀器：酶標(biāo)儀Multiskan Ex(美國(guó)Thermo Scientific公司)，流式細(xì)胞儀FACA Calibur(美國(guó)BD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞株及其培養(yǎng)方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液(RPMI 1640+10% FBS完全培養(yǎng)基)，接種細(xì)胞到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔添加100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)目為1×104個(gè)，接種后正常條件(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)6 h，調(diào)整好細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)后，設(shè)置對(duì)照組(HL-60)和實(shí)驗(yàn)組(HL-60+OA)，其中對(duì)照組不加入OA，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞按照80 μmol/L的終濃度(經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)得出的最佳濃度)加入OA，正常條件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)OA對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響 將HL-60細(xì)胞每孔100 μL接種于96孔板，常規(guī)孵育，細(xì)胞貼壁、狀態(tài)穩(wěn)定良好后，分別在24、48、72 h的時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μL CCK-8試劑，進(jìn)行標(biāo)記進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)，以不同時(shí)間點(diǎn)為起點(diǎn)，將細(xì)胞在培養(yǎng)箱內(nèi)(3 ℃和5% CO2濃度)繼續(xù)孵育4 h，然后將96孔培養(yǎng)板中的液體轉(zhuǎn)移至新的96孔板，并使用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)OA對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)采用雙染試劑盒Annexin V (FITC Apoptosis Detection Kit II)，室溫解凍后使用。dPBS洗滌細(xì)胞2次后，離心(1000 g，5 min)收集細(xì)胞沉淀，加入195 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞沉淀。加入5 μL Annexin V-FITC至195 μL細(xì)胞重懸液，混勻、避光、室溫反應(yīng)12 min后，再加入10 μL Propidium Iodide，混勻、室溫、避光、反應(yīng)5 min，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)：Ex=488 nm，Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測(cè)，PI紅色熒光通過PI通道(FL2)檢測(cè)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)在HL-60細(xì)胞中OA對(duì)PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的影響 收集并裂解HL-60細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，BCA方法檢測(cè)濃度后進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，常溫封閉2 h，用TBST緩沖液沖洗2遍，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入二抗孵育，經(jīng)過洗膜、發(fā)光、曝光、ECL放射自顯影，曝光3 min，漂洗后定影，分析檢測(cè)結(jié)果。Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K、p-AKT(Ser473)、p-AKT(Thr308)、AKT、mTOR蛋白的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)中抗體使用稀釋比見表1。

表1 Western blot中抗體的配置及分離膠濃度

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用t檢驗(yàn)和單因素方差分析比較組間差異性。P<0.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OA能夠降低HL-60細(xì)胞的增殖活性利用CCK-8法檢測(cè)OA用藥前后兩組細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果如圖1所示。在HL-60細(xì)胞加入OA藥物72 h后，對(duì)照組細(xì)胞組吸光值為(2.1±0.22)，實(shí)驗(yàn)組吸光值則為(1.48±0.12)(n=3)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活性降低，且兩組細(xì)胞增殖活性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明OA能抑制HL-60細(xì)胞的增殖。

圖1 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性(**P<0.01)

2.2 OA促進(jìn)HL-60細(xì)胞的凋亡OA與HL-60細(xì)胞共同孵育24 h，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(5.78±2.30)%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為(14.78±5.40)%(n=3)，兩組細(xì)胞凋亡率差異明顯，且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明OA能夠促進(jìn)HL-60細(xì)胞凋亡。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況

2.3 OA影響P13K/AKT通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)及磷酸化Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中P110α、p-AKT(Ser473)、p-AKT(Thr308)、p-AKT(ser473)、mTOR的表達(dá)Q情況，以β-actin與AKT作為內(nèi)參。各組細(xì)胞均檢測(cè)到了上述蛋白表達(dá)條帶，如圖3所示。用TotalLab圖像掃描軟件對(duì)CAV-1蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行灰度值分析。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞P110α、mTOR表達(dá)降低;p-AKT(Ser473)/AKT與p-AKT(Thr308)/AKT比值降低，(P<0.05)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明OA作用于HL-60細(xì)胞后P110α表達(dá)降低，AKT蛋白Ser473及Thr308位點(diǎn)磷酸化程度下降，從而使信號(hào)通路下游因子mTOR低表達(dá)。

圖3 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞P110α、p-AKT(Ser473)、p-AKT(Thr308)、mTOR蛋白表達(dá)情況

3 討論

OA及其衍生物不僅是我國(guó)臨床應(yīng)用的非處方注冊(cè)用藥，其在印度，美國(guó)和歐洲國(guó)家也被用作一種補(bǔ)充和替代藥物。OA廣泛的生物學(xué)活性支持其用于多種疾病的治療，如用于抗癌，抗骨質(zhì)疏松，抗肥胖，抗糖尿病，脂質(zhì)降低，抗炎，抗氧化，免疫調(diào)節(jié)和保肝等[8]。此外，相對(duì)于其他抗腫瘤藥物毒性大，價(jià)格昂貴等特點(diǎn)，OA具有易于提取，價(jià)格低廉，毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)。鑒于OA的這些優(yōu)勢(shì)，OA在白血病臨床治療方面的研究及臨床藥物評(píng)價(jià)也成為了一個(gè)研究熱點(diǎn)，并取得了一定進(jìn)展。

OA能夠促進(jìn)白血病腫瘤細(xì)胞的分化，對(duì)白血病腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用。OA影響APL細(xì)胞增殖與凋亡的機(jī)制較為復(fù)雜，Hong Mei LI等人通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)OA能通過靶向下調(diào)PML/RARα融合蛋白的表達(dá)抑制APL的細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[9]，楊玉等人則認(rèn)為，OA緩解APL病情進(jìn)展的作用可能與其增加cav-1基因的表達(dá)有關(guān)[10]，而在早期的研究中，我們也已經(jīng)初步證實(shí)了OA對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用，并認(rèn)為其可能通過下調(diào)HL-60細(xì)胞中PI3K、Akt、Cav-1的表達(dá)來發(fā)揮此抑制作用[11]，但是其下調(diào)P13K、AKT表達(dá)的作用機(jī)制并不清晰。為了進(jìn)一步確定OA在HL-60細(xì)胞中對(duì)PI3K/AKT通路活性的影響及作用的靶部位，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了用OA處理后的HL-60細(xì)胞的增殖活性、凋亡情況及PI3K下游信號(hào)分子AKT蛋白的Ser473位點(diǎn)和AKT蛋白Thr308位點(diǎn)磷酸化改變的情況。我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，加入OA藥物72 h后的HL-60細(xì)胞增殖活性明顯降低，且細(xì)胞的凋亡率明顯升高，驗(yàn)證了OA對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用。我們進(jìn)一步通過Western Blot發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組P110α、mTOR的表達(dá)降低，p-AKT(Ser473)/AKT與p-AKT(Thr308)/AKT比值也呈現(xiàn)降低的表現(xiàn)，這說明說明OA作用于HL-60細(xì)胞后P110α表達(dá)降低，AKT蛋白Ser473及Thr308位點(diǎn)磷酸化程度下降，而P110a、Ser473、Thr308在P13K/AKT通路的活化中起關(guān)鍵作用。具體來說，PI3K的激活方式有兩種：一種是與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長(zhǎng)因子受體或連接蛋白相互作用，引起二聚體構(gòu)象改變而被激活，另一種則是p110a直接與Ras結(jié)合導(dǎo)致PI3K的活化[12]。Ser473、Thr308則是AKT磷酸化過程中的關(guān)鍵蛋白，AKT分子的中央?yún)^(qū)含有AKT蛋白中心催化結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域內(nèi)部ATP結(jié)合位點(diǎn)的Thr308的磷酸化為AKT部分活化所必需，此外，AKT羧基末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)蛋白激酶的特征性結(jié)構(gòu)，該區(qū)域則含有AKT活化的另一個(gè)磷酸化位點(diǎn)Ser473[13]。PI3K/Akt通路的活化是多種腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵原因之一，部分白血病腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，存在PI3K/Akt/mTOR通路的持續(xù)性活化[14]，且在急性白血病患者中，PI3K/Akt通路的上調(diào)與細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)凋亡以及促進(jìn)分化的藥物耐藥也密切相關(guān)[15]。

綜上，本研究通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了OA對(duì)白血病細(xì)胞HL-60的作用，即OA能抑制HL-60細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，并進(jìn)一步證明了OA能下調(diào)P110α的表達(dá)，并使AKT蛋白Ser473及Thr308位點(diǎn)磷酸化程度下降，間接說明OA可能是通過影響P13K/AKT通路中AKT的磷酸化作用發(fā)揮抑癌作用的，但仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來直接驗(yàn)證此觀點(diǎn)。本結(jié)論對(duì)APL未來的藥物研制具有重要的理論意義，且相對(duì)于APL的一線化療藥物，OA的毒副作用明顯減少，結(jié)合其價(jià)廉易得的優(yōu)點(diǎn)，讓我們相信今后深入探討OA作用的靶點(diǎn)，并研發(fā)OA作為白血病臨床治療的藥物，具有重要意義。