安子宜，董澤嵩，霍楠楠，李 齊，黃云蕾,韓智學(xué)，楊 勇，劉洪鳳,3

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011;2.中國人民解放軍93220部隊(duì);3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000)

酒精依賴是一種慢性多因素腦疾病，具有無法控制飲酒的特征，是世界上潛在的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一[1]。目前，酒精依賴相關(guān)分子機(jī)制的研究尚不明確，Clay JM等人研究表明長期飲酒會導(dǎo)致多巴胺獎賞途徑的神經(jīng)適應(yīng)和神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)性的增加[2]。多巴胺D4受體(DRD4)是多巴胺D2類受體中的一個亞型，廣泛分布于海馬區(qū)，在酒精依賴中，記憶中心海馬區(qū)對尋覓酒精行為的作用尤為重要[3];DRD4在調(diào)節(jié)海馬區(qū)神經(jīng)傳遞中起關(guān)鍵作用，其與配體結(jié)合后可調(diào)節(jié)cAMP的水平，cAMP/PKA的改變影響酒精依賴有關(guān)的行為反應(yīng)，因此，DRD4介導(dǎo)的cAMP/PKA信號傳導(dǎo)異常可能是產(chǎn)生酒精依賴的原因[4]。故本實(shí)驗(yàn)研究DRD4/cAMP/PKA途徑在酒精依賴大鼠海馬區(qū)的表達(dá)情況，進(jìn)一步揭示酒精依賴相關(guān)的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，為治療酒精依賴提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠16只，體重170～200 g，6周齡，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司[SCXK(遼)2015-0001]。于牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級鼠類實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行動物模型的構(gòu)建及檢測。

1.1.2 試劑 總RNA提取試劑盒(北京 Solarbio公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連 Takara公司);TB Green? Premix Ex TaqTM(大連 Takara公司);引物(上海生工)。

1.1.3 儀器 高架十字迷宮(上海移數(shù)信息科技有限公司);BCN-1360B生物潔凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);NanoDrop 2000(美國 Thermo公司);S1000 Thermal Cycler PCR(美國 BIO-RAD公司);StepOne Real-Time PCR System(美國 Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備10%酒精依賴大鼠模型 將16只SPF級雄性SD大鼠單籠飼養(yǎng)，隨機(jī)數(shù)字表法分為對照(A)組(n=8)和10%酒精依賴模型(B)組(n=8)。大鼠適應(yīng)1周后制備模型。A組為雙瓶100 mL蒸餾水，B組為一瓶100 mL蒸餾水和一瓶100 mL 10%酒精，每天記錄大鼠的飲酒量(mL/24 h)、飲水量(mL/24 h)，每天更換水瓶和酒精瓶的位置、更新溶液，連續(xù)造模4周，28 d。兩組每周更換墊料，檢測大鼠體重。B組的酒精攝入量[g/(kg·24 h)]和酒精偏好逐漸穩(wěn)定時，即成功制備SD大鼠酒精依賴模型[5];在最后一次飲酒24 h后，對A組和B組大鼠進(jìn)行高架十字迷宮測試和戒斷綜合征評估，大鼠行為學(xué)改變進(jìn)一步驗(yàn)證是否成功制備模型[6]。

1.2.2 高架十字迷宮 將16只大鼠置于溫度恒定、光線恒定、昏暗的實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行高架測試。十字高架位于地面上方50 cm處，由1對開口臂和1對閉合臂組成。點(diǎn)擊測試系統(tǒng)，設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)(總活動度、進(jìn)臂次數(shù)等)完畢后，將大鼠置于“十”字中央，測試3 min，酒精棉球擦拭后，進(jìn)行下一只大鼠測試。大鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)越少，在開放臂的探索時間越短，則其焦慮程度越高[6]。

1.2.3 酒精戒斷綜合征評分(EWS) 據(jù)Motaghinejad M等[7]的方法，在模型組最后一次飲酒24 h后對兩組大鼠進(jìn)行評分，16只大鼠均在相同的環(huán)境下進(jìn)行觀測。觀測項(xiàng)目包括刻板行為、激惹性、尾巴強(qiáng)直、異常姿勢和聽源性癲癇發(fā)作情況，該5項(xiàng)中每項(xiàng)包括5個評分(1分、2分、3分、4分、5分)，5個項(xiàng)目評分之和為總評分，評分越高說明戒斷癥狀越嚴(yán)重。

1.2.4 大鼠海馬區(qū)DRD4、AC、PKA、CREB mRNA表達(dá)水平檢測 將大鼠麻醉后，頸椎脫臼處死，取出腦組織中的海馬區(qū)備用，根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書提取A組、B組大鼠海馬區(qū)的總RNA，分別用移液槍吸取2 μL的總RNA，用儀器NanoDrop2000測定RNA的濃度和OD值，重復(fù)3次，取平均值;根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄樣品配制，通過S1000 Thermal Cycler PCR進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄;采用StepOne Real-Time PCR System qPCR檢測DRD4、AC、PKA、CREB的mRNA表達(dá)水平，引物見表1。

表1 引物序列

反應(yīng)體系：根據(jù)TB Green? Premix Ex TaqTM說明書配制20 μL反應(yīng)液，包括TB GREEN 10 μL，上、下游引物(10 M)各0.4 μL，ROX Reference Dye(50X)0.4 μL，cDNA 2 μL，滅菌水6.8 μL。

反應(yīng)條件：預(yù)變性(95 ℃ 30 s);PCR反應(yīng)(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次);Melt Curve(95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s)。

mRNA的表達(dá)水平以2-△△Ct表示，在Excel中計(jì)算出△Ct，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，再計(jì)算出2-△Ct，算出2-△Ct的平均值后，將每個2-△Ct除以2-△Ct的平均值，得出2-△△Ct。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，繪圖運(yùn)用Graphpad Prism 7.0。

2 結(jié)果

2.1 酒精依賴動物模型的建立

2.1.1 建模期間兩組大鼠的體重變化 實(shí)驗(yàn)初始A組體重與B組體重比較差異沒有顯著性差異(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時A組體重與B組體重比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P>0.05)，見表2。

表2 兩組SD大鼠的體重變化

2.1.2 建模期間10%酒精依賴模型組的酒精攝入量和酒精偏好 經(jīng)過28 d循環(huán)連續(xù)飲酒，B組在最后7 d的酒精攝入量穩(wěn)定在(7.11±0.36)g/(kg·24 h)，統(tǒng)計(jì)分析表明，B組在最后7 d飲酒的酒精攝入量無顯著差異(F(6，49)=0.949，P>0.05);酒精偏好穩(wěn)定在(57.30±1.86)%，統(tǒng)計(jì)分析在最后7 d飲酒的酒精偏好無顯著差異(F(6，49)=1.860，P>0.05)，見表3。

表3 B組大鼠最后7 d飲酒的酒精攝入量和酒精偏好

2.2 高架十字迷宮測試比較各組行為學(xué)變化與A組大鼠比較，B組大鼠在B組最后一次飲酒24 h后，與A組大鼠比較，B組大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比、在開放臂滯留時間百分比明顯減少，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);然而，B組大鼠進(jìn)臂總次數(shù)與A組大鼠進(jìn)臂總次數(shù)比無顯著差異(P>0.05);B組大鼠經(jīng)過的總路程與A組大鼠經(jīng)過的總路程比無顯著差異(P>0.05),見表4。

表4 大鼠在高架十字迷宮中檢測參數(shù)

2.3 酒精戒斷評分評估大鼠的戒酒癥狀B組在飲酒期間較為溫順，不易激惹，很少出現(xiàn)攻擊性行為。但在戒酒24 h的戒斷評分明顯升高(P<0.001)，見表5。

表5 酒精依賴大鼠戒斷行為評分表

2.4 DRD4/cAMP/PKA途徑在酒精依賴大鼠海馬區(qū)的表達(dá)情況與A組相比，B組DRD4顯著升高(P<0.001)，AC、PKA、CREB顯著下降(P<0.01);B組中，與DRD4相比，AC明顯下降(P<0.001)、PKA明顯降低(P<0.0001)、CREB明顯降低(P<0.001)，見圖1。

圖1 酒精依賴后海馬中相關(guān)基因的mRNA相對表達(dá)情況

3 討論

酒精依賴是世界上最復(fù)雜的物質(zhì)成癮之一，其涉及的相關(guān)問題嚴(yán)重影響人們的生存質(zhì)量。Taraskina AE等對外周血淋巴細(xì)胞多巴胺受體進(jìn)行評價時發(fā)現(xiàn)酒精依賴與DRD4的高表達(dá)有關(guān)，DRD4基因的表達(dá)水平改變了酒精依賴行為的神經(jīng)適應(yīng)過程[8];Muntean BS等通過光遺傳學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)多巴胺觸發(fā)的cAMP改變在程序獎勵評估和成癮藥物中具有重要作用，多巴胺信號向cAMP的調(diào)制為上癮狀態(tài)中的調(diào)節(jié)作用提供了支撐[9]。

本研究結(jié)果顯示，在酒精依賴大鼠海馬區(qū)，DRD4 mRNA水平明顯升高，AC、PKA、CREB的mRNA水平明顯下降，DRD4在大腦中與情感、強(qiáng)化和動機(jī)相關(guān)的區(qū)域(如海馬等)高度表達(dá)，可以通過AC降低cAMP水平，抑制神經(jīng)元活動[10]，這表明DRD4可能通過調(diào)控cAMP/PKA通路在酒精依賴中發(fā)揮重要作用。與我們之前在比較10%雙瓶連續(xù)飲酒模型和20%雙瓶間歇飲酒模型的研究中得到的結(jié)論一致[11]，雙瓶連續(xù)飲用10%酒精建立酒精依賴大鼠模型效果良好，能有效開展實(shí)驗(yàn);酒精依賴時，大鼠海馬區(qū)DRD4高表達(dá)，AC、PKA、CREB低表達(dá)，DRD4/cAMP/PKA可能在酒精依賴產(chǎn)生的神經(jīng)適應(yīng)性改變中發(fā)揮重要作用，這為酒精依賴相關(guān)的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制的研究提供新思路。但本研究也存在一定的局限性：如:(1)通過免疫組化、western blot等分子生物學(xué)技術(shù)檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)會更好;(2)若進(jìn)一步研究DRD4影響cAMP/PKA途徑在酒精依賴大鼠海馬區(qū)的表達(dá)情況可能會更好地證實(shí)DRD4介導(dǎo)的cAMP/PKA途徑在酒精依賴發(fā)生中的機(jī)制。