姜 偉，孫兆躍，施文靜，范瑞良，李楠楠，全為民

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)重點實驗室，上海 200090）

牡蠣礁是由大量牡蠣聚集生長而形成的一種生物礁系統(tǒng)，具有凈水、去氮、固碳、提供棲息地和防止海岸線侵蝕等生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能［1-4］。然而，過度捕撈、環(huán)境污染、病害和生境破壞等導(dǎo)致全球約85%牡蠣礁已經(jīng)消失［1，5］。近幾十年來，美國、澳大利亞、歐洲和中國等陸續(xù)開展了不同尺度的牡蠣礁修復(fù)項目［6-7］。早期修復(fù)項目的目標(biāo)是增殖牡蠣種群、恢復(fù)過去繁榮的牡蠣產(chǎn)業(yè)，而最近大多數(shù)修復(fù)項目的側(cè)重點則是牡蠣礁提供的生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能［6-8］。

牡蠣是生長于硬底物上的雙殼類軟體動物，建造適合于牡蠣幼蟲附著的棲息生境（礁體）是牡蠣礁修復(fù)的重點［6-7，9］。牡蠣殼是牡蠣幼蟲附著和稚貝生長最適合的底物（substrate），早期的牡蠣礁修復(fù)項目通常優(yōu)先使用循環(huán)回收的本地牡蠣殼建造礁體［6-7］。但由于牡蠣殼資源量和可獲取性的制約，許多牡蠣礁修復(fù)項目則使用舊（old）牡蠣殼、蛤殼、混凝土、石塊、竹子、木材、塑料和橡膠等替代底物［6-7］。研究表明，各種底物的附苗效果通常隨著時間、地點和項目設(shè)計而有較大差異［6-9］。

牡蠣礁修復(fù)中使用的牡蠣殼分為兩類：一類為活牡蠣被食用后循環(huán)回收的新牡蠣殼（以下簡稱新殼），另一類為從自然牡蠣礁或海底疏?；厥盏呐f牡蠣殼（以下簡稱舊殼）。由于經(jīng)濟(jì)成本低和資源量大，舊殼被大量地應(yīng)用于牡蠣礁修復(fù)中［7］。然而，目前少見比較新、舊殼對牡蠣幼蟲附著的誘導(dǎo)力和生物接受度的研究［6-7］。另外，筆者在江蘇海門蠣岈山和福建深滬灣牡蠣礁野外調(diào)查中均發(fā)現(xiàn)：牡蠣礁表面的舊殼上幾乎沒有牡蠣稚貝補(bǔ)充（recruitment），而新殼和人工海堤上分布著高密度的活體牡蠣。

本研究采用室內(nèi)和野外附著實驗，比較了新、舊殼的附苗效果，檢驗了生物膜對新、舊殼附苗效率的影響，比較了2個潮區(qū)中新、舊殼上牡蠣和藤壺附著量的差異，評估了新、舊殼作為牡蠣礁修復(fù)底物的適宜性，以期為指導(dǎo)牡蠣礁修復(fù)和牡蠣增養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用的兩種牡蠣殼均采自江蘇海門蠣岈山牡蠣礁。新殼為活體近江牡蠣（Crassostrea ariakensis）成體的左殼；舊殼為蠣岈山牡蠣礁剖面下層的死亡近江牡蠣的左殼，經(jīng)14C年代測定法測得其年齡為279～86 a BP。牡蠣殼經(jīng)去除表面污損生物、清洗和太陽曝曬后備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡蠣殼和生物膜對牡蠣附著量影響的實驗設(shè)計

室內(nèi)附著實驗于2019年6—7月在北部灣大學(xué)欽州實驗基地開展。采用雙因子隨機(jī)區(qū)組實驗設(shè)計，2個自變量為牡蠣殼（新殼和舊殼）和生物膜（有生物膜處理組和無生物膜對照組）。有生物膜處理組：挑選形態(tài)大小基本一致的新、舊殼各1只組成一個試驗組，放入流動的300目篩絹網(wǎng)過濾的自然海水中浸泡72 h作為生物膜處理，設(shè)置5個實驗重復(fù)。無生物膜對照組：挑選形態(tài)大小基本一致的新、舊殼各1只組成一個試驗組，保持干燥作為無生物膜處理，設(shè)置5個實驗重復(fù)。實驗所用的牡蠣殼拍照后使用ImageJ軟件（1.46R）測定其表面積。當(dāng)育苗池（3 m×5 m×1.5 m）內(nèi)人工培育的熊本牡蠣（Crassostrea sikamea）浮游幼蟲大部分處于眼點幼蟲（幼蟲密度約2個·L-1）期時，將各試驗組牡蠣殼吊掛于育苗池水面下1 m處進(jìn)行附苗，實驗水溫28℃、鹽度24，3 d后移至苗種培育池中暫養(yǎng)，15 d后對實驗?zāi)迪牃ど细街哪迪犞韶愡M(jìn)行計數(shù)，牡蠣附著量統(tǒng)計為單位牡蠣殼表面積內(nèi)稚貝的數(shù)量（個·cm-2）。

野外附著實驗在浙江省象山港底部的熊本牡蠣自然采苗區(qū)開展。實驗設(shè)計與上述室內(nèi)實驗一致。2019年7月26日將各試驗組牡蠣殼吊掛于牡蠣附苗筏架上，保持所有牡蠣殼處于相同潮區(qū)（平均最低低水位以上1.2 m），實驗期間海水溫度27～29℃、鹽度22～24；2019年9月4日回收實驗?zāi)迪牃ぃ谑覂?nèi)對牡蠣殼上附著的牡蠣稚貝進(jìn)行計數(shù)，牡蠣附著量統(tǒng)計為單位牡蠣殼表面積內(nèi)稚貝的數(shù)量（個·cm-2）。

牡蠣附著量數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后，采用雙因子方差分析（two-way ANOVA）檢驗?zāi)迪牃ず蜕锬δ迪牳街康挠绊懀捎肨ukey后檢驗進(jìn)行多重比較（α＝0.05），統(tǒng)計分析在Sigmaplot 10.0軟件中完成。

1.2.2 牡蠣殼和潮區(qū)對牡蠣和藤壺附著量的影響實驗設(shè)計

本實驗于2020年7—9月在浙江省三門縣健跳港上游潮間帶牡蠣養(yǎng)殖區(qū)開展。該水域牡蠣優(yōu)勢種為熊本牡蠣，幼蟲附著補(bǔ)充高峰期為8月，實驗期間水溫25.0～32.2℃、鹽度7.2～24.9。采用雙因子隨機(jī)區(qū)組實驗設(shè)計，2個自變量為牡蠣殼（新殼和舊殼）和潮區(qū)（灘面以上0.6 m和1.1 m）。在潮間帶低潮區(qū)沿平行于水邊線方向搭建附苗架，相鄰附苗架間相距10 m，每個附苗架設(shè)置2個潮區(qū)水平，每個潮區(qū)設(shè)置5個實驗重復(fù)。挑選形態(tài)大小基本一致的新、舊殼各1只組成1個試驗組，2020年7月7日將10個試驗組牡蠣殼分別固定到5個附苗架的不同潮區(qū)，所有牡蠣殼均水平固定、其內(nèi)表面朝上。分別于15 d（7月22日）、45 d（8月22日）和70 d（9月17日）后，對實驗?zāi)迪牃ど细街哪迪牶吞賶剡M(jìn)行計數(shù)；從同一處理水平的試驗組中分別隨機(jī)選取30只牡蠣稚貝，使用游標(biāo)卡尺測量其殼高。運用雙因子方差檢驗?zāi)迪牃ず统眳^(qū)對牡蠣和藤壺附著量以及牡蠣殼高的影響，數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法見1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣殼和生物膜對牡蠣附著量的影響

雙因子方差分析結(jié)果表明：在2019年室內(nèi)附著實驗中，牡蠣殼和生物膜均顯著影響牡蠣附著量（表1，P＜0.05），2個因子之間沒有顯著的交互作用（表1，P＞0.05）。牡蠣殼和生物膜對牡蠣附著量的影響如圖1-A所示，在生物膜處理下，新、舊殼上牡蠣附著量的大小順序為：新殼＞舊殼（P＜0.05）；而在對照組中，新、舊殼間牡蠣附著量無顯著差異（P＞0.05）。生物膜顯著提高了新殼的附著量（P＜0.05），但對舊殼的附著量無顯著影響（P＞0.05）。

在2019年野外附著實驗中，牡蠣殼和生物膜均顯著影響牡蠣附著量（表1，P＜0.05），2個因子之間存在顯著的交互作用（表1，P＜0.05）。牡蠣殼和生物膜對牡蠣附著量的影響如圖1-B所示，在生物膜處理下，新、舊殼上牡蠣附著量沒有顯著差異（P＞0.05）；而在對照組中，牡蠣附著量的大小順序為：新殼＞舊殼（P＜0.05）。生物膜顯著提高了舊殼的牡蠣附著量（P＜0.05），但對新殼的牡蠣附著量沒有顯著影響（P＞0.05）。

2.2 牡蠣殼和潮區(qū)對牡蠣和藤壺附著量的影響

雙因子方差分析結(jié)果表明：在2020年野外附著實驗中，牡蠣殼顯著影響了牡蠣附著量（表2，P＜0.01），而潮區(qū)對牡蠣附著量沒有顯著影響（表2，P＞0.05），2個因子之間無顯著的交互作用（表2，P＞0.05）。在每個潮區(qū)中，新、舊殼15 d、45 d和70 d時牡蠣附著量的大小順序均為：新殼＞舊殼（圖2，P＜0.05）。新殼上牡蠣附著量的時間變化為：45 d和70 d均顯著高于15 d（圖2，P＜0.05）；舊殼上牡蠣附著量的時間變化0.6 m潮區(qū)中也呈現(xiàn)上述特征（圖2-A，P＜0.05），而在1.1 m潮區(qū)中舊殼上牡蠣附著量在各附著周期內(nèi)均無顯著差異（圖2-B，P＞0.05）。

表1 牡蠣殼和生物膜對牡蠣附著量影響的二維方差分析結(jié)果Tab.1 Results from two-way ANOVA exam ining effects of oyster shell and biofilm on the densities of settled oysters

圖1 2019年室內(nèi)實驗（A）和野外實驗（B）中新殼和舊殼上牡蠣附著量Fig.1 Settled oyster densities on the fresh and old oyster shells in the lab（A）and field（B）experiments of 2019

在2020年野外附著實驗中，牡蠣殼對藤壺附著量沒有顯著影響（表2，P＞0.05），而潮區(qū)顯著影響著藤壺附著量（表2，P＜0.05），2個因子之間沒有顯著的交互作用（表2，P＞0.05）。僅在0.6 m潮區(qū)、15 d時藤壺附著量的大小順序為：新殼＞舊殼（圖3-A，P＜0.05）；而在其他試驗組中，新、舊殼上藤壺附著量的差異均不顯著（圖3，P＞0.05）。在每個潮區(qū)中，藤壺附著量的時間變化均呈現(xiàn)為：45 d和70 d均顯著高于15 d（圖3，P＜0.05）。

表2 牡蠣殼和潮區(qū)對牡蠣和藤壺附著量影響的二維方差分析結(jié)果Tab.2 Results from two-way ANOVA exam ining the effects of oyster shell and tidal zone on the densities of settled oysters and barnacles

圖2 2020年野外實驗中新殼和舊殼上牡蠣附著量Fig.2 Settled oyster densities on the fresh and old oyster shells in the field experiment of 2020

圖3 2020年野外實驗中新殼和舊殼上藤壺附著量Fig.3 Settled barnacle densities on the fresh and old oyster shells in the field experiment of 2020

在2020年野外附著實驗中，牡蠣殼和潮區(qū)對附著牡蠣殼高的影響均不顯著（表3，P＞0.05），2個因子之間沒有顯著的交互作用（表3，P＞0.05）。所有試驗組中，新、舊牡蠣殼附著牡蠣殼高均無顯著差異（圖4，P＞0.05）；在每個潮區(qū)中，附著牡蠣殼高的時間變化均呈現(xiàn)為：45 d和70 d顯著高于15 d（圖4，P＜0.05）。

3 討論

合適的底物是吸引牡蠣幼蟲附著和成功修復(fù)牡蠣礁的關(guān)鍵因素之一［6，9-10］。牡蠣殼因其表面結(jié)構(gòu)粗糙，殼內(nèi)含豐富鈣元素，同時其復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)降低了牡蠣幼蟲在附著時受到水流因素的干擾，為浮游幼蟲的成功附著創(chuàng)造了有利條件［11-12］。PRESTON等［13］發(fā)現(xiàn)，在新的同種牡蠣殼上歐洲牡蠣（Ostreaedulis）稚貝附著量顯著高于舊殼。LOPES［14］研究發(fā)現(xiàn)，腐蝕嚴(yán)重的牡蠣殼上附著生物十分稀少。2019年野外實驗（對照組）和2020年野外實驗結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，新殼上的牡蠣附著量顯著高于舊殼，驗證了新殼對牡蠣幼蟲附著的誘導(dǎo)能力顯著大于舊殼這一假設(shè)。而且這兩種牡蠣殼對牡蠣幼蟲附著的吸引力也受到生物膜的影響，如2019年室內(nèi)實驗中生物膜處理下兩種牡蠣殼間牡蠣附著量存在顯著差異。新、舊殼是自然牡蠣礁體上常見的兩種殼型，牡蠣死亡后其硬殼部分不會迅速降解，在很長一段時間內(nèi)會繼續(xù)保留在礁體上，充當(dāng)牡蠣幼蟲的附著底物［15］。但由于長期遭受生物與非生物因素侵蝕，舊殼的外觀結(jié)構(gòu)與內(nèi)部成分都發(fā)生了改變，如牡蠣殼表面變得光滑、殼內(nèi)鈣素流失，不再含有新殼中殘存的牡蠣分泌物成分，從而導(dǎo)致舊殼的附苗效果逐步下降［16-17］。但本研究也發(fā)現(xiàn)，藤壺在新、舊殼上附著量沒有差異，表明藤壺幼蟲對新、舊殼并未表現(xiàn)出明顯的附著偏好。

表3 牡蠣殼和潮區(qū)對附著牡蠣殼高影響的二維方差分析結(jié)果Tab.3 Results from two-way ANOVA exam ining the effects of oyster shell and tidal zone on the shell height of settled oysters

圖4 2020年野外實驗中新殼和舊殼上附著牡蠣的平均殼高Fig.4 Shell height of settled oysters on the fresh and old oyster shells in the field experiments of 2020

生物膜能夠?qū)Π迪犜趦?nèi)的多種海洋無脊椎動物的附著行為產(chǎn)生顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)［18-20］，主要通過釋放與成年牡蠣相似的化學(xué)信號，用以指示最佳棲息位點，從而誘導(dǎo)浮游幼蟲 附 著 變 態(tài)［19］。RODRIGUEZ-PEREZ等［11］發(fā)現(xiàn)，生物膜能明顯誘導(dǎo)歐洲牡蠣幼蟲附著，附著效率會隨著時間的延長而提高。本研究的室內(nèi)實驗結(jié)果顯示，生物膜顯著提高新殼的附苗效率，但不影響舊殼的附苗效率；而在野外實驗中得出的結(jié)果完全相反，生物膜顯著提高舊牡蠣的附苗效率，但對新殼的附苗效率沒有影響。這種結(jié)果可能與實驗周期和兩種牡蠣殼上生物膜生長差異有關(guān)。相較于舊殼，新殼上生物膜發(fā)育得更好，能在短期（室內(nèi)實驗附苗周期為3 d）內(nèi)快速提升新殼的附苗效率，但在較長周期（野外實驗附苗周期約40 d）內(nèi)隨著牡蠣附著量的逐步增加其效果會下降；而在舊殼上生物膜發(fā)育得相對較差，短期內(nèi)對舊殼的附苗效率影響有限，但在較長周期內(nèi)其對附苗效率的累積影響是明顯的。

潮區(qū)是影響牡蠣附著的關(guān)鍵因子之一，附著潮區(qū)過低或過高都不利于牡蠣幼蟲的附著、生長與存活［21-23］。已有研究結(jié)果表明，不同種類牡蠣偏好附著于不同的潮區(qū)，發(fā)育后期的浮游幼蟲通常會垂直向下遷移尋找最適的附著位點［21-24］。本研究發(fā)現(xiàn)，潮區(qū)對兩種牡蠣殼上牡蠣附著量的影響并不顯著，可能是由于兩個實驗潮區(qū)的高度間隔較小，浮游幼蟲的垂直附著差異并不明顯。在同一潮區(qū)中，兩種牡蠣殼間附著稚貝的殼高未見顯著性差異，可以初步確定這兩種牡蠣殼并不會對稚貝的生長速率起決定性的誘導(dǎo)或抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，新殼的附苗效果總體好于舊殼，而且這種差異涵蓋了整個牡蠣繁殖、附著及補(bǔ)充高峰期。因此在牡蠣礁修復(fù)中應(yīng)優(yōu)先選取新殼作為底物，尤其在牡蠣幼蟲豐度較低的環(huán)境中。未來需進(jìn)一步從殼表化學(xué)組成及微結(jié)構(gòu)等方面闡明兩種牡蠣殼間附苗效果差異的原因及機(jī)理。