鮑虞園，葉國玲，李銀康，謝木嬌，藍軍南，頡曉勇

（1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣州 510300；2.上海海洋大學，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

中國鱟（Tachypleustridentatus），隸屬于肢口綱（Merostomata），劍 尾 目（Xiphosura），鱟 科（Limulidae），東方鱟屬，因頭胸部具有發(fā)達的馬蹄形背甲，故又被稱為馬蹄蟹。鱟主要生活在淺海沙質(zhì)海底，喜棲息于鹽度較低的河口，同時具有溯河而上的習性［1］。其主要分布于中國東南沿海、日本以及東南亞等地［2］。鱟為典型的雜食性動物，其自然餌料涵蓋面極廣且混雜，尤其喜愛攝食海洋浮游植物、微藻類及底棲無脊椎動物［3-4］。鱟在醫(yī)藥、科研、民俗文化及沿海生態(tài)保護等方面為人類提供了極為重要的利用價值，但隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，鱟的棲息地環(huán)境遭受污染、破壞甚至消失，使其種群資源大量衰退，中國鱟更是岌岌可危［5］。中國大陸已將鱟列入“名貴珍稀水生動物”，中國香港也將其列入保護項目［6］，2019年3月，世界自然保護聯(lián)盟（IUCN）正式將中國鱟在IUCN紅色名錄中的等級從原本的數(shù)據(jù)缺乏（data deficiencies）更新為瀕危（endangered）。因此鱟資源的保護與恢復已迫在眉睫，而人工育苗和人工增殖放流是恢復鱟資源種群數(shù)量行之有效的措施之一［7］。

消化系統(tǒng)是動物對食物進行消化、吸收、排出的主要場所，是動物新陳代謝的基本保證，直接關(guān)系到動物的生長和發(fā)育。研究水產(chǎn)動物消化系統(tǒng)的發(fā)育過程有助于人們從根本上了解不同時期幼體消化系統(tǒng)的完善程度，從而在育苗生產(chǎn)中能準確掌握苗種開口期的餌料需求，這對養(yǎng)殖及餌料營養(yǎng)等方面的研究具有重要的現(xiàn)實意義。相關(guān)研究在國內(nèi)外已有不少報道，研究對象主要集中在魚類［8-12］、蝦［13-14］、蟹［15-16］等經(jīng)濟型水產(chǎn)動物。消化道是消化系統(tǒng)的主要組成部分，觀察消化道組織的發(fā)育是了解其攝食、消化及吸收營養(yǎng)物質(zhì)過程機制的主要途徑，在魚類、甲殼類及較低等的環(huán)節(jié)動物等均有較多的研究［17-22］。然而國內(nèi)關(guān)于鱟的消化道組織學研究較少見，呂林蘭和董學興［23］和劉正琮等［24］分別對圓尾鱟（Carcinoscorpiusrotundicauda）和中國鱟的消化道組織結(jié)構(gòu)進行了觀察，謝木嬌等［25］對圓尾鱟消化道粘液細胞分布進行了研究，陳秀荔［26］和劉偉茹［27］對圓尾鱟和中國鱟消化道進行了組織學比較分析。而關(guān)于中國鱟消化道發(fā)育過程的組織學研究在國內(nèi)外更是鮮見報道。研究表明，目前鱟的消化道劃分尚無統(tǒng)一的標準［26］，本文參考洪水根［28］的劃分方法將中國鱟的消化道劃分為食道、胃、中腸、直腸等幾大部分，采用石蠟連續(xù)切片和H-E染色技術(shù)，對15日齡～2齡及成年中國鱟的消化道發(fā)育過程進行組織學觀察，初步探討其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以期為后續(xù)中國鱟幼體消化生理、生化方面的研究奠定基礎(chǔ)，也為苗種科學管理和營養(yǎng)飼料的合理選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用中國鱟均來自廣東省湛江市中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所中國鱟研究基地。

1.2 實驗方法

2018年5—9月在廣東湛江對中國鱟進行人工繁育技術(shù)研究［17］。在水溫28～32℃、鹽度26～30、pH 7.4～7.8的條件下，受精卵經(jīng)歷約45 d胚胎發(fā)育孵化成1齡稚鱟，又經(jīng)約90 d發(fā)育蛻殼進入2齡。從孵化后第1天開始，直至1齡稚鱟蛻殼進入2齡，每天取稚鱟10尾；成年個體解剖取出消化道，分離食道、胃、中腸和直腸。樣品置于4%多聚甲醛中固定24 h后，轉(zhuǎn)入70%的乙醇中保存。將固定好的樣品流水沖洗12 h，經(jīng)50%～100%梯度乙醇脫水（50%乙醇2 h、70%乙醇4 h、80%乙醇2 h、85%乙醇2 h、95%乙醇45 min×2、100%乙醇45 min×2），二甲苯透明（1／2無水乙醇＋1／2二甲苯混合液1 h、二甲苯15 min×2），浸蠟（石蠟2 h×2），石蠟包埋，以4～6μm的厚度進行縱向連續(xù)切片，蘇木精-伊紅（H-E）染色，中性樹脂封片，在ZEISS Axio Scope.A1型光學顯微鏡下觀察并攝影記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 食道

15日齡，食道壁僅見黏膜層和黏膜下層，肌層與漿膜尚未形成。黏膜層和黏膜下層形成2～3個較寬大的黏膜皺褶向腔面突起，食道腔較小。黏膜層為單層柱狀上皮，上皮細胞高柱狀，界限模糊，頂部著色較淺，核基位，深染，此時尚未有幾丁質(zhì)層形成，亦未見有纖毛。黏膜下層與疏松結(jié)締組織交替，界限不清晰，其中有零星肌纖維及游走細胞分布（圖版Ⅰ-A）。26日齡，食道腔稍有增大，黏膜皺褶仍為2～3個，黏膜層呈紫紅色，細胞界限模糊，黏膜上皮頂層著色加深且形成一深色條帶，疑似纖毛層或初期的幾丁質(zhì)層。黏膜下層與疏松結(jié)締組織界限仍未區(qū)分，但其中肌纖維開始延伸（圖版Ⅰ-B）。至60日齡，食道腔明顯增大，黏膜皺褶增加至4～5個。黏膜上皮細胞的細胞核開始清晰，基位，深染，上皮細胞頂部出現(xiàn)纖毛，形成淺紅色的紋狀緣。黏膜下層與疏松結(jié)締組織界限開始逐漸形成，其之間的肌纖維數(shù)量增加，形成肌纖維環(huán)及其他單體肌纖維束，趨向于形成肌肉層（圖版Ⅰ-C）。

2齡，食道直徑及其內(nèi)腔均明顯較前期大，黏膜皺褶增加至9～12個，其中大皺褶為6～7個，小皺褶為4～5個，大皺褶靠近頂部有分叉。黏膜層的上皮細胞界限不清晰，但其細胞核較清晰，呈紫紅色，基位。黏膜上皮頂部的紋狀緣消失，開始形成一小薄層幾丁質(zhì)層，呈粉紅色。黏膜層和黏膜下層開始區(qū)分。肌肉層開始出現(xiàn)，由8～10個肌纖維束環(huán)組成，其細胞核深染，結(jié)構(gòu)清晰，肌纖維束環(huán)之間有少數(shù)結(jié)締組織分布，兩者共同形成肌肉層。肌肉層外形成有結(jié)締組織薄膜組成的漿膜層，與周圍疏松結(jié)締組織區(qū)分明顯。此時食道的組織結(jié)構(gòu)基本發(fā)育完善（圖版Ⅰ-D）。

成年中國鱟，食道可解剖分解，上端為口，下端與前胃相連。其組織結(jié)構(gòu)由內(nèi)到外由幾丁質(zhì)層、黏膜層、黏膜下層、肌肉層及漿膜5層結(jié)構(gòu)組成。各層結(jié)構(gòu)完整且區(qū)分明顯。黏膜皺褶高度和寬度均較前期大，10～12個，多為分叉，往腔面突起幾乎充滿整個內(nèi)腔。幾丁質(zhì)明顯較前期厚，往黏膜層延伸，靠腔面一側(cè)形成染色較深的外緣帶。肌肉層緊密且較厚，其間的結(jié)締組織較少（圖版Ⅰ-E）。

2.2 胃

15日齡，胃壁的黏膜層和黏膜下層尚未區(qū)分明顯，共同向胃腔突起形成6～8個黏膜皺褶，皺褶較矮，胃腔較大。黏膜層為單層柱狀上皮，細胞矮柱狀，核基位，呈紫紅色。黏膜下層與肌肉層亦尚未區(qū)分，肌肉層僅有3～5個肌纖維環(huán)及大量結(jié)締組織組成。漿膜由結(jié)締組織及間皮細胞組成，外與疏松結(jié)締組織相連（圖版Ⅰ-F）。26日齡，胃壁黏膜層的上皮細胞呈高柱狀，核基位，嗜堿性增強，著色加深，細胞頂部形成深染的外緣，或?qū)l(fā)育形成幾丁質(zhì)層。黏膜皺褶增高，呈波浪形排列。肌肉層的肌纖維增加，形成數(shù)個環(huán)形肌束，其中仍有較多的結(jié)締組織分布。漿膜著色加深，與周圍疏松結(jié)締組織開始區(qū)分明顯（圖版Ⅰ-G）。至60日齡，胃壁黏膜上皮細胞嗜堿性增加，呈深紫色，細胞頂部深染外緣擴大且著色加深，形成纖毛狀向腔面游離。黏膜皺褶高度變化不明顯。肌肉層的肌束增加，紅染區(qū)域增大。漿膜層的間皮細胞嗜堿性增強，核深染（圖版Ⅰ-H）。

2齡，胃壁黏膜皺褶迅速增高，有13～15個，往腔面呈指狀突起，其頂部已形成較厚的幾丁質(zhì)層。黏膜上皮細胞高柱狀，核較大，基位，呈深紫色；肌肉層增厚，為環(huán)肌，結(jié)締組織減少；漿膜與周圍結(jié)締組織界限明顯；此時胃組織結(jié)構(gòu)基本形成（圖版Ⅰ-I，J）。

成年個體，胃的解剖結(jié)構(gòu)可分為前胃和幽門。前胃黏膜皺褶呈波浪形向胃腔突起，頂部呈指狀或鐘形，有14～16個，其幾丁質(zhì)層較厚。黏膜下層有放射肌，肌肉層發(fā)達，厚度明顯較前期厚（圖版Ⅰ-K）。幽門部由幽門內(nèi)壁、幽門外壁及腸壁組成，前端連接前胃，后端深入腸腔形成一套疊結(jié)構(gòu)，均有波浪形或鋸齒狀的黏膜皺褶向幽門腔和腸腔突起（圖版Ⅰ-L）。此為發(fā)育完全的胃組織結(jié)構(gòu)。

2.3 中腸

15日齡，中腸壁黏膜層與黏膜尚未區(qū)分，有6～8個黏膜皺褶向中腸腔突起。黏膜層為單層柱狀上皮，細胞呈矮柱狀，核基位，細胞頂部邊緣著色較深，或?qū)l(fā)育形成紋狀緣。肌肉層尚未形成，僅有1～2個肌纖維束環(huán)及結(jié)締組織形成。漿膜與周圍疏松結(jié)締組織尚未區(qū)分明顯（圖版Ⅱ-A）。30日齡，中腸壁黏膜層與黏膜下層界限不明顯，黏膜上皮頂部形成粉紅色的紋狀緣；黏膜皺褶高度增高，向中腸腔延伸。肌肉層的肌纖維束增厚，還有其他肌纖維及結(jié)締組織。漿膜層著色較深，與周圍疏松結(jié)締組織開始區(qū)分（圖版Ⅱ-B）。70日齡時，中腸壁組織結(jié)構(gòu)清晰，黏膜皺褶高度增高，有9～11個，向腸腔延伸，上皮細胞嗜堿性增強，細胞界限不清晰，核基位，紋狀緣著色加深。肌肉層為肌纖維束環(huán)，漿膜為結(jié)締組織及間皮細胞組成，著色加深（圖版Ⅱ-C）。

2齡，中腸壁各層組織結(jié)構(gòu)已區(qū)分明顯，黏膜皺褶幾乎充滿腸腔，紋狀緣明顯增厚，未見有幾丁質(zhì)層結(jié)構(gòu)形成。肌肉層增厚，多為環(huán)肌。漿膜與周圍疏松結(jié)締組織分離（圖版Ⅱ-D）。

成年個體，中腸壁完整結(jié)構(gòu)由黏膜層、黏膜下層、肌肉層和漿膜組成（圖版Ⅱ-E）。黏膜上皮頂部為較厚的紋狀緣，無幾丁質(zhì)層包裹。黏膜皺褶寬大，多為分叉，形成鋸齒狀。黏膜上皮細胞高柱狀，核基位，頂部為粉紅色紋狀緣，上皮底部為深紅色的基帶與黏膜下層隔開。黏膜下層與肌肉層界限不清晰。環(huán)肌和縱肌及結(jié)締組織交錯。漿膜為間皮和結(jié)締組織（圖版Ⅱ-F）。此為發(fā)育完全的中腸壁組織結(jié)構(gòu)。

2.4 直腸

15日齡，直腸壁各層結(jié)構(gòu)尚未區(qū)分，僅見較厚黏膜層，向腸腔形成波浪形皺褶，腸腔較小。黏膜層外僅有一側(cè)有少量肌纖維形成；漿膜層與周圍結(jié)締組織尚未區(qū)分（圖版Ⅱ-G）。30日齡，直腸直徑增大，黏膜皺褶4～5個，黏膜上皮嗜堿性增強，上皮細胞矮柱狀，核基位，頂部形成粉紅色紋狀緣。黏膜下層與肌肉層尚未區(qū)分，肌纖維增加形成肌纖維束環(huán)。漿膜與周圍疏松結(jié)締組織界限不清晰（圖版Ⅱ-H）。至70日齡，直腸壁黏膜層嗜堿性增強，上皮頂部的紋狀緣著色加深；黏膜下層與肌肉層仍未明顯區(qū)分；肌肉層肌纖維束增厚；漿膜層有一側(cè)與周圍疏松結(jié)締組織分離（圖版Ⅱ-I）。

2齡，直腸直徑明顯增大，直腸壁由黏膜層、黏膜下層、肌肉層及漿膜組成。黏膜皺褶10～12個，呈指狀向腔面突起；黏膜上皮頂部幾丁質(zhì)層發(fā)育形成，多有分叉，呈鋸齒狀包裹黏膜上皮。黏膜下層與肌肉層界限不明顯，肌肉層增厚，由肌纖維束及結(jié)締組織形成。漿膜明顯，由間皮和結(jié)締組織形成，與周圍結(jié)締組織分離（圖版Ⅱ-J）。此時，直腸各層組織結(jié)構(gòu)基本發(fā)育完成。

成年個體，直腸可解剖分離，直徑較大。直腸壁幾丁質(zhì)層、黏膜層、黏膜下層、肌肉層及漿膜均明顯較前期厚。幾丁質(zhì)層較厚，多有鋸齒狀突起，其下為深染的條帶與黏膜層隔開。黏膜皺褶為波浪形，有10～15個大型皺褶，各大型皺褶上分多個次級皺褶。黏膜上皮細胞矮柱狀，核基位，嗜堿性較強。黏膜下層分布有較多大小不一的放射肌。肌肉層厚，內(nèi)層為不連續(xù)環(huán)肌，外層為縱肌。漿膜亦增厚，由間皮及結(jié)締組織組成（圖版Ⅱ-K，L）。此為發(fā)育完全的直腸結(jié)構(gòu)。

3 討論

3.1 中國鱟消化道發(fā)育的組織學特征

中國鱟消化道組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育過程呈現(xiàn)逐漸復雜的規(guī)律。15日齡，消化道各段組織結(jié)構(gòu)基本類似，黏膜層最早形成，黏膜層是黏液腺及黏液細胞分布的主要部位［29］，其主要功能是分泌黏液，在保護潤滑、消化吸收、免疫防御、離子轉(zhuǎn)運等方面具有重要作用［30-32］。黏膜層的形成，為食物的消化吸收提供了基本可能，黏膜上皮由多種不同的細胞組成，包括柱狀細胞、內(nèi)分泌細胞、黏液細胞，這些細胞的分泌物起到潤滑作用并參與了消化過程。此時，黏膜層與黏膜下層向消化道內(nèi)腔凸起形成較矮的黏膜皺褶，擴大了消化道與食物的接觸面積，以便提高消化能力。肌層尚未形成，說明此時稚鱟的消化道收縮能力較弱，其攝食能力較弱或尚未開始攝食。26日齡，食道和胃的黏膜上皮頂部出現(xiàn)深染條帶，根據(jù)劉正琮等［24］對中國鱟消化道的研究，該條帶可能是幾丁質(zhì)層或紋狀緣的早期階段。30日齡，中腸和后腸的黏膜上皮頂部形成粉紅的紋狀緣，紋狀緣為發(fā)達的微絨毛，可進一步加大吸收面積［26］；消化道各段肌纖維數(shù)量增加，其收縮能力增強。60日齡，消化道黏膜皺褶明顯增高，肌肉層形成；食道和胃黏膜上皮頂部深色條帶發(fā)育成紋狀緣，至70日齡，中腸和直腸的紋狀緣著色加深，表明其消化功能逐漸增強。到2齡，中國鱟消化道組織由黏膜層、黏膜下層、肌肉層及漿膜組成，各層區(qū)分明顯。其中，食道、胃和直腸的黏膜上皮頂部有幾丁質(zhì)層包裹，而中腸黏膜上皮頂部為紋狀緣，這與劉正琮等［24］和陳秀荔等［26］對成年中國鱟消化道的研究結(jié)果基本一致，表明2齡中國鱟的消化道組織結(jié)構(gòu)基本完善，具備基本的攝食及消化能力。成年中國鱟消化道可在解剖學上劃分為食道、胃（前胃和幽門）、中腸和直腸等部分，在組織學上各部分可明顯區(qū)分，食道、胃和直腸的幾丁質(zhì)層均明顯比2齡時要厚，黏膜皺褶和肌肉層十分發(fā)達，其中黏膜下層有較多的放射肌分布，該結(jié)果與其他學者的結(jié)果基本一致，這是與其消化功能相適應的體現(xiàn)［23-24，26］。

3.2 中國鱟消化道組織結(jié)構(gòu)發(fā)育與攝食的關(guān)系

鱟為雜食性動物，其自然餌料十分復雜［26］。ELZINGA［33］運用穩(wěn)定同位素標記的方法對鱟的食性進行研究，結(jié)果表明較小齡期的幼鱟主要依賴腐屑及粘附在基底質(zhì)上的有機微粒為主要餌料，隨著年齡的增長逐漸過渡為多毛類及甲殼類，成鱟則以更大的雙殼類及腹足類為食。另外，圓尾鱟及中國鱟幼體也喜食昆蟲幼蟲、小型多毛類等小型食物［34］。而陳秀荔等［26］和劉偉茹［27］通過對中國鱟和圓尾鱟消化道外部形態(tài)觀察、形態(tài)測量、組織切片觀察及形態(tài)指數(shù)的定量分析，表明中國鱟與圓尾鱟消化道形態(tài)組織結(jié)構(gòu)與其雜食性密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，1齡稚鱟消化道組織發(fā)育較為緩慢，組織結(jié)構(gòu)尚未完善，肌肉層尚不發(fā)達，食道和胃的幾丁質(zhì)層尚未形成，并不具備攝食和消化大型餌料的能力，因此推測正處于消化道發(fā)育初期階段的1齡稚鱟主要消耗內(nèi)源性營養(yǎng)，尚未開始攝食或僅攝食少量腐屑或有機微粒來加強消化道的發(fā)育。有研究顯示，將1齡稚鱟置于高密度餌料的水體中飼養(yǎng)，并未觀察到其進食，由此推測1齡稚鱟并未開始攝食，僅由卵黃提供營養(yǎng)［35］。2齡幼鱟的消化道發(fā)育基本完善，與成鱟的組織結(jié)構(gòu)基本類似，其食道的幾丁質(zhì)層和肌肉層開始形成，為攝食和消化提供了可能，幾丁質(zhì)層可保護食道不被食物損傷，肌肉層的形成增加了食道的收縮能力，有助于將食物向胃推進，加上發(fā)達的黏膜皺褶，增加食物與消化道的接觸面，可暫時容納食物，使之與黏液充分接觸，更利于食物的推進；胃發(fā)達的黏膜皺褶及其表面的幾丁質(zhì)層以及發(fā)達的肌肉層可有效研磨食物，使之免受損傷；中腸形成發(fā)達黏膜皺褶和微絨毛，增加了吸收面積，符合消化吸收主要場所的典型特點；直腸發(fā)達的黏膜皺褶便于食物殘渣中的水分和無機鹽回收利用，從而調(diào)節(jié)血液的滲透壓和離子平衡，幾丁質(zhì)層可使直腸壁在殘渣向肛門推移的過程中免受損傷［26-27，36-37］。中國鱟2齡個體消化道組織結(jié)構(gòu)特點表明該時期開始具備攝食及消化的能力，此階段應是幼鱟開始攝食的關(guān)鍵時期。此外，對中國鱟攝食規(guī)律進行觀察研究發(fā)現(xiàn)，中國鱟在2齡時開始攝食豐年蟲，本研究結(jié)果與之相吻合［35］。成年中國鱟消化道的組織結(jié)構(gòu)進一步發(fā)育完善，幾丁質(zhì)層及肌肉層顯著增厚，黏膜皺褶增高，且黏膜下層出現(xiàn)放射肌，增加了消化道的蠕動和消化吸收功能［35］，喻示成年中國鱟的攝食能力已明顯增強，可捕獲較大的多毛類和甲殼類作為主要食物［33］，食量也會進一步增加以滿足其生長發(fā)育的需要。

中國鱟的消化生理研究文獻匱乏，如黏液細胞的發(fā)育特征及消化酶活性的變化與攝食習性的關(guān)系等，亟需進一步多角度開展研究。本研究結(jié)果補充了中國鱟的基礎(chǔ)生物學內(nèi)容，可為今后開展其他消化生理學研究、資源開發(fā)利用和保護提供理論參考。

圖版Ⅱ 中國鱟中腸和直腸的發(fā)育PlateⅡ Development ofm idgut and rectum in T.tridentatus