李 辰，修建波，許 琪

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005)

抑郁癥(depressive disorder)是一種發(fā)病時表現(xiàn)為情緒低落、興趣減退和愉悅感喪失等癥狀的精神疾病[1]。雖然近年來已發(fā)現(xiàn)多種抑郁癥的治療手段，但傳統(tǒng)的抗抑郁藥對大多數(shù)患者不能起到很好的效果。PARP14是聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly-adenosine diphosphate-ribose polymerase, PARP)18個家族成員之一，它可以將ADP核糖從NAD+分子中裂解出并轉(zhuǎn)移到目標(biāo)蛋白上，實現(xiàn)該蛋白的翻譯后單ADP核糖基化修飾。已有臨床研究提示一些原批準用于惡性腫瘤治療的PARP家族抑制劑在抑郁癥治療中的潛力[2]，而PARP家族成員在抑郁癥中的表達量變化尚未見報道。

除了在DNA損傷修復(fù)、抑制癌中發(fā)揮作用外[3]，PARP14被發(fā)現(xiàn)是一類參與炎性反應(yīng)調(diào)控的分子，如調(diào)控巨噬細胞炎性反應(yīng)、促進B細胞生存等[4-5]。而神經(jīng)炎性反應(yīng)假說長久以來被認為是導(dǎo)致抑郁癥的主要機制之一，抑郁癥患者外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有較高水平的促炎細胞因子，例如白介素1β(IL-1β)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)等[6]。小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的固有先天免疫細胞，其功能異常與抑郁癥發(fā)生密切相關(guān)[7]。本研究旨在探究PARP14與抑郁癥的相關(guān)性及其在小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)過程中起到的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：用于建模的8周雄性C57BL/6J小鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院實驗動物中心。

1.1.2 細胞培養(yǎng)：小鼠永生化小膠質(zhì)細胞系BV2為本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑：脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(L8880, Solarbio公司)；PARP14抗體及siRNA(sc377150 & sc76057， Santa Cruz公司)；GeA-69(HY-108708, MCE公司)；細胞培養(yǎng)用胎牛血清(04-001-1ACS, BI公司); DMEM、0.25%胰蛋白酶、青霉素鏈霉素(CC15019、CC017、CC004,邁晨公司)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000與Lipofectamine RNA iMAX(11668019 & 13778150, Thermo Fisher Scientific公司)；Trizol(15596018, Invitrogen公司)；cDNA合成試劑盒(04379012001, Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 抑郁癥動物模型的建立：1)慢性束縛模型[chronic restraint(CRS) model]模型建立按照文獻[8]執(zhí)行，將18只小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組9只。將實驗組小鼠連續(xù)21 d隨機時間放入塑料管中(每天4～6 h)進行建模，對照組無處理，建模結(jié)束后進行行為學(xué)測試及樣本收集；CRS建模同時，將18只小鼠隨機分為6組，每組3只，分別束縛0、1、3、5、7、14 d后取腦組織樣本。2)慢性不同預(yù)知壓力模型[chronic unpredictable mild stress(CUMS)model]使用實驗室前期建模存留樣本[9]。3)LPS模型[lipopolysaccharide(LPS) model]建立按照先前文獻[10]執(zhí)行，將8只小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組4只，實驗組小鼠腹腔注射LPS 1 mg/kg，對照組小鼠注射0.9%氯化鈉溶液，24 h后收集小鼠海馬組織。

1.2.2 行為學(xué)檢測：強迫游泳測試(forced swim test, FST)和糖水偏愛測試(sucrose preference test, SPT)被用于測試模型小鼠的抑郁樣行為。強迫游泳測試可以反映出小鼠行為上的絕望，測試時將小鼠放入透明的1 000 L燒杯中，用錄像設(shè)備記錄小鼠6 min內(nèi)的行為，計數(shù)后4 min小鼠的不動時間；糖水偏愛測試前3 d小鼠進行雙瓶飲水訓(xùn)練(一瓶正常飲水、一瓶1.5%蔗糖溶液)，測試前24 h禁水，測試時允許動物自由攝取水或蔗糖溶液，2 h后記錄并計算小鼠的蔗糖偏愛度：蔗糖偏愛度(sucrose preferences，%)=蔗糖消耗量/總消耗量×100%。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及處理：BV2細胞系以56 ℃預(yù)處理1 h、含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2濃度的細胞培養(yǎng)箱中，隔天傳代。BV2細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)?；騭iRNA時接種至六孔板，培養(yǎng)18～24 h后按轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個復(fù)孔，過表達組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PARP14質(zhì)粒，過表達對照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒；敲低組轉(zhuǎn)染PARP14 si RNA，敲低對照組轉(zhuǎn)染陰性對照si RNA。分別于轉(zhuǎn)染后6、24 h換液，38～44 h后加入200 nmol/L LPS，LPS處理6 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。抑制劑組于細胞接種后40 h加入250 nmol/L PARP14抑制劑GeA-69，無抑制劑對照組加入DMSO，處理2 h后再加入200 nmol/L LPS，LPS處理6 h后收集細胞。

1.2.4 RNA提取與基因表達量檢測：取新鮮海馬組織液氮速凍后保存于-80 ℃直至使用。RNA提取使用Trizol勻漿和氯仿層分離法分離RNA。用轉(zhuǎn)錄本cDNA合成試劑盒將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行后續(xù)RT-qPCR檢測。檢測引物見表1，結(jié)果以2-ΔΔCt進行相對定量計算。

表1 RT-qPCR檢測引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism6.0和SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組數(shù)據(jù)使用Student’st檢驗進行組間差異分析；多組數(shù)據(jù)使用單因素方差分析，組間值使用q分析；使用Person相關(guān)性檢驗進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 抑郁癥模型小鼠海馬區(qū)PARP14表達水平升高

強迫游泳實驗和蔗糖偏愛實驗證實CRS模型組相比對照組表現(xiàn)出明顯的絕望及快感缺失等抑郁樣表型(P<0.01)(圖1A,B)。CRS模型小鼠海馬區(qū)中的PARP14蛋白及mRNA表達水平皆顯著高于對照組(P<0.05)(圖1C～E)。同時，PARP14蛋白和mRNA表達水平在束縛第14天時顯著升高(P<0.05)(圖1F,G)。此外，在CUMS模型海馬區(qū)也觀察到PARP14蛋白表達水平相較于對照組顯著升高(P<0.05)(圖1H,I)。

Male C57BL/6 mice were exposed to chronic restraint (CRS) model or chronic unpredictable mild stress (CUMS) model induction; A,B.CRS- treated mice and control(Ctrl) mice behaviors: A.forced swim tests, B.sucrose preference tests(n=9); C,D.PARP14 levels in hippocampus of CRS/Ctrl mouse brains, n=3 experimental replicates/group; E.PARP14 mRNA levels in hippocampus of CRS/Ctrl mouse brains(n=5); F,G.PARP14 protein and mRNA levels in mice hippocampus at different restraint time points (0D: CRS 0 day, 1D: CRS 1 day, 3D: CRS 3 day, 5D: CRS 5 day, 7D: CRS 7day dand 14D: CRS 14 day)， #P<0.05 compared with CRS 0 day group; H,I.PARP14 levels in hippocampus of CUMS/Ctrl mouse brains(n=3); *P<0.05, **P<0.01 compared with Ctrl group圖1 CRS和CUMS模型海馬區(qū)PARP14的表達水平升高Fig 1 PARP14 levels were increased in the hippocampus of CRS and CUMS

2.2 PARP14與神經(jīng)炎性反應(yīng)相關(guān)

在CRS模型小鼠海馬組織中，炎性因子IL-1β mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.05)(圖2A)，且PARP14與IL-1β mRNA表達水平正相關(guān)(r=0.868,P<0.05)。LPS模型小鼠海馬中，PARP14 mRNA和蛋白表達也顯著上調(diào)(P<0.05)(圖2B,C)。BV2細胞中，PARP14 mRNA表達水平在LPS刺激3、6和12 h后均有顯著升高(P<0.01)(圖3A)；同時，PARP14蛋白表達水平在LPS處理6 h后顯著升高(P<0.05)(圖3B,C)。

A.IL-1β mRNA levels in the hippocampus of CRS/Ctrl mouse brains; B.PARP14 mRNA levels in the hippocampus of mice treated with LPS or saline; C.PARP14 protein levels in hippocampus of LPS/control mouse brains； *P<0.05 compared with Ctrl group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with saline group圖2 PARP14表達水平與神經(jīng)炎性反應(yīng)相關(guān)Fig 2 PARP14 expression was related to neuroinflammatory n=4)

A.PARP14 mRNA expression in BV2 cells with LPS treated in different times(0, 3, 6, 12 hours); B,C.PARP14 expression in PBS and LPS group(PSB: BV2 cells treated with PBS in 6 hours, LPS: BV2 cells treated with LPS in 6 hours; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with PBS group圖3 BV2細胞LPS刺激后PARP14表達水平升高Fig 3 PARP14 levels were up-regulated in LPS treated BV2 n=3)

2.3 BV2細胞中過表達PARP14增強LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)

BV2細胞中，過表達組PARP14 mRNA水平顯著升高(P<0.001)(圖4A)。經(jīng)6 h LPS處理，PARP14過表達組產(chǎn)生的促炎細胞因子TNF-α mRNA顯著升高(P<0.01)(圖4B)，同時抑炎細胞因子白介素10(IL-10) mRNA表達有下降的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4C)。

2.4 BV2細胞中敲低Parp14和抑制劑處理降低LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)

在BV2細胞中，敲低組PARP14 mRNA表達水平與對照組相比顯著降低(P<0.05)(圖4D)。與過表達組相反，敲低組LPS處理后促炎細胞因子IL-1β mRNA表達水平顯著低于對照組(P<0.05)， 且IL-10mRNA水平有升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4E,F)。LPS刺激BV2細胞后，PARP14抑制劑GeA-69處理相較于無抑制劑對照組，其促炎因子IL1-β mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)(圖4G)，同時TNF-α mRNA表達水平也表現(xiàn)出下降趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4H,I)。

A.PARP14 mRNA expression in EGFP+LPS/PARP14+LPS group(EGFP+LPS: BV2 cells over-expression EGFP and then treated with LPS, PARP14+LPS: BV2 cells over-expression PARP14 and then treated with LPS); B.TNF-α mRNA expression in EGFP+LPS/PARP14+LPS group; C.IL-10 mRNA expression in EGFP+LPS/PARP14+LPS group; D.PARP14 mRNA expression in si-NC+LPS/si-PARP14+LPS group(si-NC+LPS: BV2 cells transfected with si-NC and then treated with LPS, si-PARP14+LPS: BV2 cells transfected with si-PARP14 and then treated with LPS); E.IL-1β mRNA expression in si-NC+LPS/si-PARP14+LPS group; F.IL-10 mRNA expression in si-NC+LPS/si-PARP14+LPS group; G.IL-1β mRNA expression in DMSO+LPS/GeA+LPS group(DMSO+LPS: BV2 cells pre-treated with DMSO before treated with LPS, GeA+LPS; BV2 cells pre-treated with 250 nmol/L GeA-69 before treated with LPS); H.TNF-α mRNA expression in DMSO+LPS/GeA+LPS group; I.IL-10 mRNA expression in DMSO+LPS/GeA+LPS group; *P<0.01, **P<0.001 compared with EGFP+LPS group; #P<0.05 compared with si-NC+LPS group; ▲P<0.01 compared with DMSO+LPS group圖4 BV2細胞中過表達PARP14增強LPS誘導(dǎo)的炎性因子表達Fig 4 PARP14 levels were up-regulated in hippocampus of LPS induced depression models and LPS treated

3 討論

海馬作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，與許多情緒相關(guān)的腦區(qū)(如前額葉皮層和杏仁核)形成神經(jīng)纖維連接，是當(dāng)前抑郁障礙相關(guān)研究較多的一個腦區(qū)[11]。本實驗通過對CRS和CUMS兩種慢性應(yīng)激小鼠模型海馬中PARP14的mRNA和蛋白表達水平進行分析，發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激會引起PARP14表達升高，證實了海馬區(qū)PARP14表達水平與抑郁癥的相關(guān)性。同時，本研究發(fā)現(xiàn)CRS模型海馬區(qū)存在IL-1β mRNA表達水平的升高，這與神經(jīng)炎性假說中慢性應(yīng)激引發(fā)神經(jīng)炎性反應(yīng)的觀點相符[6]。重要的是，本研究也發(fā)現(xiàn)了PARP14 mRNA表達水平與IL-1β mRNA表達水平呈正相關(guān)，提示PARP14可能會通過影響神經(jīng)炎性反應(yīng)從而對抑郁癥產(chǎn)生影響。本研究在LPS模型中的發(fā)現(xiàn)也進一步驗證了PARP14與神經(jīng)炎性相關(guān)的假設(shè)。

由于小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的炎性反應(yīng)細胞類型，在慢性應(yīng)激情況下，與抑郁癥相關(guān)的大腦區(qū)域小膠質(zhì)細胞從靜止?fàn)顟B(tài)變?yōu)榛顒訝顟B(tài)，這也被認為是造成壓力期間中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)的重要原因[12]。當(dāng)使用LPS刺激小膠質(zhì)細胞時，也觀察到了PARP14蛋白及其mRNA表達水平的升高，這提示PARP14可能在小膠質(zhì)細胞中發(fā)揮作用從而影響神經(jīng)炎性反應(yīng)。當(dāng)改變小膠質(zhì)細胞PARP14表達后觀察到了其響應(yīng)LPS刺激后炎性反應(yīng)的變化， PARP14在小膠質(zhì)細胞中的過表達可以以通過增加促炎基因的表達，從而增強小膠質(zhì)細胞的炎性反應(yīng)；而Parp14在小膠質(zhì)細胞中的敲低或抑制可以通過抑制促炎基因的表達從而抑制小膠質(zhì)細胞的炎性反應(yīng)。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)PARP家族的macro亞家族成員PARP14與抑郁癥的相關(guān)性，并提示其可能通過調(diào)控小膠質(zhì)細胞活化而對抑郁樣行為產(chǎn)生影響，但其影響小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)的機制仍然有待研究。雖然之前已發(fā)現(xiàn)一些以抑制PARP1為主的PARP家族抑制劑在一些案例中起到了緩解抑郁癥癥狀的作用[2]。但不同于PARP1介導(dǎo)的多聚ADP核糖基化修飾的廣泛作用[13]，PARP14介導(dǎo)的單ADP核糖基化修飾作用可能更為特異，因此其特異性抑制劑潛在的副作用可能也會更小。本研究表明PARP14很有可能成為抑郁癥治療有希望的靶標(biāo)。