崔亞婷，勾文峰，魏會(huì)強(qiáng)，于 江，侯文彬*，李祎亮*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192)

酸性核質(zhì)DNA結(jié)合蛋白1(acidic nucleoplasmic DNA-binding protein 1, And-1)主要在細(xì)胞核中表達(dá)，具備WD40重復(fù)序列(WD-repeat,WD40，WDR)和高遷移率組蛋白框結(jié)構(gòu)域(high mobility group-box motif,HMG-box motif)家族的雙重特性[1]，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能多樣。BLAST數(shù)據(jù)庫顯示，果蠅、秀麗隱桿線蟲、擬南芥、神經(jīng)孢子囊、非洲爪蟾中均檢測到了與人類And-1高度相似的蛋白質(zhì)， 表明該蛋白家族高度保守。And-1家族基因包括來自裂殖酵母的mcl1、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的Ctf4、曲霉(Aspergillusnidulans)的SepB以及人類的And-1。該家族基因包含SepB結(jié)構(gòu)域，SepB盒是該蛋白家族獨(dú)有的共性特點(diǎn)，也是區(qū)分WD40蛋白或其他傳導(dǎo)蛋白重要的特征。主要影響DNA復(fù)制、修復(fù)以及姐妹染色體凝聚等[2]。And-1的結(jié)構(gòu)與Ctf4和 Mcl1略有不同，除N端WD40和SepB結(jié)構(gòu)域外，其在C末端還有一個(gè)HMG結(jié)構(gòu)域。WD40能介導(dǎo)蛋白與蛋白的相互作用[3]，而HMG蛋白則具有DNA結(jié)合的特性[4]。因此，它的功能比Ctf4/Mcl1更復(fù)雜、多樣。

1 And-1的結(jié)構(gòu)特征

And-1由氨基末端WD40重復(fù)序列、中間SepB結(jié)構(gòu)域和羧基末端HMG框結(jié)構(gòu)域共同組成(圖1A)，該蛋白又名WD重復(fù)序列與HMG-box DNA結(jié)合蛋白1(WD-repeat/-domain and HMG-box/-domain DNA binding protein 1, WDHD1)。其包含1 127個(gè)氨基酸，總分子質(zhì)量為125 ku，pI為5.27[5]。WD40結(jié)構(gòu)域包含7個(gè)葉片結(jié)構(gòu)，形成1個(gè)環(huán)狀的α-螺旋槳(圖1B)。SepB結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)WD40子結(jié)構(gòu)域和一個(gè)螺旋子結(jié)構(gòu)域，其中WD40子結(jié)構(gòu)域包含6個(gè)串聯(lián)刀片狀結(jié)構(gòu)，形成了具有間隙的環(huán)形結(jié)構(gòu)(圖1C)；螺旋子結(jié)構(gòu)域由5個(gè)α螺旋(α1-α5)組成，以螺旋束的形式位于WD40子域的底部[6]。而And-1羧基末端的HMG框結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)目前還未被報(bào)道。

A.And-1結(jié)構(gòu)域成分概述; B.WD40結(jié)構(gòu)域(左，PDB ID：5GVA)； C.SepB結(jié)構(gòu)域(右，PDB ID：5GVB); aa.氨基酸圖1 And-1蛋白結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1 Structure diagram of And-1

2 And-1的結(jié)構(gòu)功能

WD40結(jié)構(gòu)域是真核基因組中最豐富、相互作用最強(qiáng)的結(jié)構(gòu)域之一，其介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，并協(xié)調(diào)下游泛素化、組蛋白甲基化等作用。WD40結(jié)構(gòu)域通常由7個(gè)β螺旋結(jié)構(gòu)共同組成圓形結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中心具有一定的大小空腔，可以與藥物小分子以較高的親和力進(jìn)行結(jié)合，介導(dǎo)參與關(guān)鍵伴侶蛋白的相互作用。此外WD40結(jié)構(gòu)域的側(cè)面和底部也可作為小分子藥物結(jié)合位點(diǎn)，從而參與一系列生理過程[7]。以WD40結(jié)構(gòu)域的蛋白作為藥物靶點(diǎn)開發(fā)新藥目前已有報(bào)道，如WDR5、EED蛋白。

SepB結(jié)構(gòu)域參與介導(dǎo)And-1三聚體的形成。該結(jié)構(gòu)域的螺旋束部分是聚合酶α相互作用的結(jié)合位點(diǎn)。釀酒酵母Ctf4的結(jié)構(gòu)中，螺旋H2和 H4之間的半閉合槽可為酵母Pol催化亞基(Pol1)提供結(jié)合位點(diǎn)，二者之間的相互作用是由Pol1的CIP基序介導(dǎo)[8]。And-1與Polα的結(jié)合與Ctf4不同，其主要通過And-1的C端區(qū)域與Polα的特異性B亞基相互作用[6]，而與Polα的CIP基序相互作用很弱。

HMG蛋白屬于DNA結(jié)合特征家族。HMG-box/HMGB是由Box A N末端結(jié)構(gòu)域、Box B中央結(jié)構(gòu)域和酸性C末端結(jié)構(gòu)域共同組成特征性結(jié)構(gòu)域[9]。研究顯示，Box A結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA，Box B結(jié)構(gòu)域結(jié)合并增強(qiáng)DNA彎曲，而C末端尾巴對DNA結(jié)合和彎曲特性起調(diào)節(jié)作用[10-11]。HMG蛋白通過調(diào)節(jié)DNA結(jié)合和彎曲活性來控制DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)的過程，從而對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響[12]。此外，另有研究表明，And-1與DNA的結(jié)合由SepB和HMG之間的中間區(qū)域介導(dǎo)。推測這可能是因Polα與AND-1′C末端之間的相互作用，從而影響And-1的HMG結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合。

3 And-1的生化功能(圖2)

圖2 And-1生物功能示意圖Fig 2 Schematic diagram of And-1 biological function

3.1 參與Pre-RC的組裝

真核DNA的復(fù)制開始之前包括復(fù)制前復(fù)合物(pre-replication complex,pre-RC)的組裝、激活和形成復(fù)制體等多步驟準(zhǔn)備過程。And-1首先參與復(fù)制起點(diǎn)處的標(biāo)記蛋白六亞基起源識別復(fù)合物(origin recognition complex,ORC)的組裝。隨后，加載微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance proteins,MCM)復(fù)合體的關(guān)鍵蛋白Cdc6和Cdt1，在G1期與ORC結(jié)合[13]。HBO1是一種H4特異性組蛋白乙?；?，對于Cdt1的復(fù)制許可至關(guān)重要[14]。然而And-1作為MCM2-7負(fù)載在染色質(zhì)上的關(guān)鍵元素，可以通過獨(dú)立于HBO1的方式促進(jìn)Cdt1和MCM2-7之間的相互作用。加載MCM之后，And-1將Cdc45和GINS加載到pre-RC上，有助于CMG(Cdc45-MCM-GINS)復(fù)合體的形成。

3.2 參與 DNA復(fù)制

在高等真核生物中CMG復(fù)合物的形成需要SepB和HMG結(jié)構(gòu)域的參與，And-1可與DNA聚合酶α、CMG解旋酶復(fù)合物相互作用，橋接CMG解旋酶與DNA聚合酶α，從而協(xié)調(diào)DNA解鏈和聚合酶活性，調(diào)控DNA復(fù)制[6]。缺少HMG結(jié)構(gòu)域的Ctf4只能依賴于SepB結(jié)構(gòu)域與復(fù)制體進(jìn)展復(fù)合物(replisome promoting complex,RPC)[15]。研究表明，Ctf4和RPC之間的相互作用主要取決于Ctf4與GINS的相互作用，而GINS是RPC中存在的CMG復(fù)合物，在DNA復(fù)制過程中，Ctf4協(xié)調(diào)CMG復(fù)合物與Polα作用[16]。因此DNA復(fù)制需要CMG復(fù)合物參與，而細(xì)胞中CMG復(fù)合物的成熟需要And-1或Ctf4， 其在DNA復(fù)制中發(fā)揮重要的橋梁紐帶作用[17]。

3.3 參與DNA 修復(fù)

DNA雙鏈斷裂(dobule strand break,DSB)是最致命的DNA損傷類型，可能導(dǎo)致有害基因的產(chǎn)生和染色體重排， 從而誘導(dǎo)癌發(fā)生。DNA雙鏈損傷修復(fù)主要包含非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源重組(homologous recombination,HR)兩種方式[18]。And-1通過調(diào)節(jié)DNA末端切除來參與同源重組[19]，并且And-1在同源重組過程中擔(dān)負(fù)著雙重職責(zé)，一種是將CtIP招募至DSB部位，另一種是在具有復(fù)制壓力的細(xì)胞中參與Chk1激活。在HR修復(fù)方式中，腫瘤抑制蛋白CtIP對于DSB末端切除必不可少，并以MRN(MER11-RAD50-NBS1)依賴的方式被招募到DSB部位[20]。And-1通過與CtIP以及其他修復(fù)蛋白形成復(fù)合物，招募CtIP到DSB位點(diǎn)上調(diào)節(jié)DSB末端切除。此外，將And-1招募到DSB位點(diǎn)還依賴于BRCA1、MDC1和ATM(Ataxia telangectasia mutated)。研究表明，And-1與BRCA1和MDC1存在相互作用，而BRCA1的BRCT(BRCA1 C-terminal domain)結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏nd-1的再生至關(guān)重要，但并不直接結(jié)合And-1[19]。

在DSB誘導(dǎo)后，依賴MRN/ATM的DSB末端切除導(dǎo)致形成ssDNA區(qū)域，該區(qū)域促進(jìn)ATR激活并通過ATR引起Chk1磷酸化。在沒有And-1或CtIP的情況下，Chk1的磷酸化降低且DSB末端切除受損。And-1在T826處被ATR磷酸化，這是And-1-Claspin相互作用對復(fù)制壓力的反應(yīng)所必需的，但其在T826處的磷酸化對And-1招募或DSB末端切除沒有影響。Claspin是一種與Chk1相互作用的蛋白，可通過蛋白與蛋白之間的相互作用將Chk1帶入停滯的復(fù)制叉，以使其被ATR磷酸化。ATR磷酸化And-1是響應(yīng)復(fù)制應(yīng)激中Chk1激活的關(guān)鍵[21]。

3.4 參與姐妹染色單體的內(nèi)聚

姐妹染色單體的聚集對于減數(shù)分裂和有絲分裂中的染色體分離至關(guān)重要。研究顯示，減數(shù)分裂中姐妹染色體分離之前，And-1耗盡的細(xì)胞停滯在前中期和中期，其對姐妹染色體的正確分離至關(guān)重要。在G1早期，著絲粒蛋白A(CENP-A)的特異性沉積需要And-1與CENP-A相互作用，And-1介導(dǎo)CENP-A與Holliday連接識別蛋白(Holliday junction recognition protein, HJURP)在著絲粒定位。And-1的下調(diào)能導(dǎo)致有絲分裂早期細(xì)胞的積累，并造成染色體收縮的缺陷；And-1過表達(dá)能增強(qiáng)著絲粒處的CENP-A裝配。因此，And-1與HJURP一起作用，促進(jìn)CENP-A向著絲粒的細(xì)胞周期特異性募集[22]。

4 And-1與癌

And-1在許多腫瘤細(xì)胞中呈過表達(dá)，尤其是在睪丸癌、惡性淋巴瘤、尿路上皮癌和惡性黑色素瘤，而在腎癌以及大多數(shù)肝癌和胰腺癌均為陰性。AKT1激酶磷酸化后能穩(wěn)定癌細(xì)胞中的And-1蛋白，抑制PI3K/AKT通路會(huì)降低肺癌中And-1磷酸化的水平，提示其可能是參與癌癥的AKT下游分子。選擇性靶向AKT1和And-1之間的功能性相互作用，極有可能是一種有前景的癌癥治療策略[23]。研究也發(fā)現(xiàn)，And-1能通過促進(jìn)MAPRE2在肺腺癌中的泛素化而導(dǎo)致順鉑耐藥[24]。敲除And-1基因的細(xì)胞中添加細(xì)胞周期特異性化療藥物，如依托泊苷、PARP抑制劑AZD2281，均可有效提高藥物的敏感性[25]。以上種種證據(jù)表明，And-1與潛在耐藥性密切相關(guān),選擇性降解And-1，可以顯著提高許多抗癌藥物在癌中的治療作用。

5 問題與展望

And-1是近年來新發(fā)現(xiàn)的DNA結(jié)合蛋白，在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，并且參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和損傷修復(fù)等遺傳相關(guān)的生命過程。目前人們對于該靶點(diǎn)的研究仍然處于剛剛起步階段，And-1的功能機(jī)制仍需進(jìn)一步探索和完善，相關(guān)小分子抑制劑的開發(fā)也需進(jìn)一步探索和開發(fā)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)了一類化合物直接作用And-1，抑制DNA損傷修復(fù)，在抗腫瘤和腫瘤化放療增敏中起作用。本文對And-1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及功能進(jìn)行了詳細(xì)的綜述，該蛋白WD40結(jié)構(gòu)域的中心空腔口袋可作為小分子藥物的主要靶向結(jié)合區(qū)，通過選擇抑制蛋白與蛋白相互作用，發(fā)揮重要的調(diào)控功能。積極深入研究And-1在DNA遺傳和損傷修復(fù)的作用機(jī)制，有助于廣譜抗癌機(jī)制的藥物發(fā)現(xiàn)；聯(lián)合其他靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物，能協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤作用，并解決腫瘤藥物耐藥等難題。對該靶點(diǎn)藥物的研發(fā)將是一個(gè)新穎且極具發(fā)展前景的抗腫瘤策略。