劉曼玉，趙萬里，劉吉華

(中國藥科大學(xué) 江蘇省中藥評價與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211198)

河谷地不容(StephaniaintermediaLo)為防己科千金藤屬植物，含有多種類型的芐基異喹啉類生物堿(Benzylisoquinoline alkaloids，BIAs)，如具有鎮(zhèn)痛作用的四氫巴馬汀及紫堇達(dá)明、抗菌藥效的小檗堿及抗腫瘤作用的金黃紫堇堿等[1-5]。目前BIAs主要從藥用植物中提取獲得，多為微量成分，自然資源有限，如紫堇達(dá)明在河谷地不容中的含量僅為0.038～3.42mg/g[6]。此外，BIAs具有稠環(huán)結(jié)構(gòu)且多數(shù)化合物具有手性中心，該類化合物化學(xué)合成路線復(fù)雜、手性拆分困難且對環(huán)境不友好。因此BIAs的來源嚴(yán)重制約其進(jìn)一步的開發(fā)和臨床應(yīng)用。

合成生物學(xué)的迅速發(fā)展為天然藥效物質(zhì)的生物技術(shù)制備提供了新的策略，解析高活性天然成分的生物合成途徑及其關(guān)鍵酶是實(shí)現(xiàn)異源生物合成的基礎(chǔ)。課題組前期對河谷地不容中BIAs生物合成途徑下游的部分甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了鑒定和功能驗(yàn)證[7]，但是河谷地不容中BIAs生物合成途徑上游的關(guān)鍵酶還有待闡明。甲基轉(zhuǎn)移酶可將供體S-腺苷L-蛋氨酸的甲基轉(zhuǎn)移至受體上，從而形成S-腺苷-L-同型半胱氨酸和甲基化分子[8-9]。甲基化在植物次生代謝中起著中心作用，它能引導(dǎo)中間體進(jìn)入特定的生物合成途徑[10-11]。O-甲基轉(zhuǎn)移酶參與生物堿生物合成后的甲基化修飾過程，極大豐富了生物堿的種類。

多數(shù)BIAs共用一個上游合成途徑，如嗎啡、小檗堿、血根堿[12]。這幾種生物堿共同的生源合成途徑以酪氨酸為前體物質(zhì)，經(jīng)過多步酶催化反應(yīng)生成這些化合物的一個共同中間體牛心果堿。去甲烏藥堿6-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(norcoclaurine 6-O-methyltransferase，6OMT)是BIAs生物合成中催化發(fā)生甲基化的第一個酶，催化去甲烏藥堿的C-6位羥基的甲基化[12]；3′羥基-N-甲基烏藥堿4′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(3′-hydroxy-N-methylcoclaurine-4′-O-methyltransferase，4′OMT)催化3′羥基-N-甲基烏藥堿產(chǎn)生牛心果堿。前期研究發(fā)現(xiàn)S.intermedia含有豐富而重要的生物堿，因此研究其生物合成途徑及其調(diào)控具有重要意義。以S.intermedia為材料，克隆獲得3個O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2(Si表示基因來源于S.intermedia)，對3個O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行生物信息學(xué)相關(guān)分析，并分別構(gòu)建至表達(dá)載體pGEX-6P-1中表達(dá)蛋白，為BIAs合成途徑解析及異源合成積累一定的科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

河谷地不容材料來自江蘇省中藥評價與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 質(zhì)粒和菌株

試驗(yàn)中主要質(zhì)粒和菌株如表1所示。

表1 試驗(yàn)所用質(zhì)粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this experiment

1.1.3 試劑

氨芐青霉素購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)快速染液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(C115)試劑盒、HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR mix (2 × Easy Taq mix)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Gflex DNA polymerase購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)為BioSHARP公司產(chǎn)品；植物RNA試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒為Omega Bio-tek公司產(chǎn)品；LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基為Mdbio Inc公司產(chǎn)品。

1.1.4 試驗(yàn)儀器

PCR儀(Bio-Rad T100 Thermal Cycler，美國)、電泳系統(tǒng)(Bio-Rad 1645050，美國)、凝膠成像儀(Bio-Rad Universal Hood Ⅱ，美國)；微量分光光度計(jì)(Nanodrop100，博克科技有限公司)；超聲波細(xì)胞粉碎儀(JY92-ⅡDN，寧波新芝生物科技股份有限公司)；恒溫?fù)u床(HYL-C，太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆

課題組前期對河谷地不容的塊根和葉組織部位進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組從頭測序，通過生物信息學(xué)分析，挖掘出參與BIAs合成的基因序列Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2。采用植物RNA試劑盒提取樣品總RNA，并對提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，如表2。采用PCR對cDNA和載體質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增(反向擴(kuò)增的質(zhì)粒)PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃，1 min；變性98℃，10 s；退火57℃，15 s；延伸68℃，1 min；30循環(huán)；后延伸68℃，10 min。用1%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，切膠回收DNA片段。利用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(C115)試劑盒進(jìn)行同源重組構(gòu)建質(zhì)粒，并利用熱擊法將重組液轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定后挑選陽性單克隆進(jìn)行測序, PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性，5 min；94℃變性，30 s；55℃退火，30 s；72℃延伸，1 min；30個循環(huán)次數(shù)；72℃后延伸，10 min。

表2 河谷地不容O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因擴(kuò)增所用引物Table 2 Primers for amplification of O-methyltransferasegenes in S. intermedia

1.2.2 生物信息學(xué)分析

使用NCBI數(shù)據(jù)庫中的ORF Finder查找該基因的開放閱讀框；用Blast程序?qū)?個甲基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行同源性搜索；用Conserved domain finder程序分析3個基因保守結(jié)構(gòu)域；利用DNAMAN軟件對不同來源的O-甲基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列進(jìn)行多重比對[13-14]；利用EXPASY在線工具預(yù)測蛋白的理化性質(zhì)。利用MEGA.5軟件，以鄰接算法，每個分支的自舉頻率基于1 000次迭代構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15-16]。用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的酶的信息見表3。表格中縮寫如下：金黃紫堇堿9-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(scoulerine 9-O-methyltransferase，SOMT)、非洲防己堿-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(columbamineO-methyltransferase，CoOMT)、牛心果堿-7-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(reticuline 7-O-methyltransferase，7OMT)、兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(catecholO-methyltransferase，CaOMT)、O-甲基轉(zhuǎn)移酶(O-methyltransferase，OMT)、去甲牛心果堿-7-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(norreticuline-7-O-methyltransferase，N7OMT)。

表3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用氨基酸序列信息Table 3 Amino acid sequence information usedto construct phylogenetic tree

1.2.3 蛋白的原核表達(dá)

從E.coliDH5α菌株中抽提質(zhì)粒，并分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于抗性平板上，過夜培養(yǎng)。挑取單菌落，接入5 mL LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)過夜得種子液。將種子液按1%接種量接種至50 mL含有1‰氨芐青霉素抗性的TB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)3.5 h(OD600=0.6～0.8)，加入終濃度為0.1 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，16℃，200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

1.2.4 表達(dá)蛋白的可溶性檢測

取100 mL誘導(dǎo)完畢的菌液分次加入50 mL離心管中，6000 ×g,離心3 min棄上清，沉淀用10 mL pH=7.4 buffer重懸，超聲破碎。取100 μL破碎液，12 000 ×g離心5 min，吸取80 μL。沉淀加入1 mL ddH2O重懸離心棄上清，再以80 μL ddH2O重懸。上清和沉淀分別加入20 μL 5×loading buffer，100℃煮沸5 min。制備好的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后進(jìn)行凝膠成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的擴(kuò)增

采用PCR從河谷地不容cDNA中擴(kuò)增出3個O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因，Si4′OMT基因全長948 bp，其中開放閱讀框?yàn)?33 bp，編碼311個氨基酸；Si6OMT1基因全長1032 bp，其中開放閱讀框?yàn)?029 bp，編碼343個氨基酸；Si6OMT2基因全長1080 bp，其中開放閱讀框?yàn)?062 bp，編碼354個氨基酸。圖1結(jié)果顯示PCR克隆得到的條帶大小與目的基因序列大小一致，條帶經(jīng)切膠回收，用于后續(xù)克隆。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

采用同源重組克隆技術(shù)將目的基因與載體連接，重組液通過感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，再經(jīng)過氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得陽性單菌落。以pGEX5′/pGEX3′引物對挑取的單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，電泳圖如圖2。從菌落PCR結(jié)果可以判斷目的片段已成功插入至表達(dá)載體的克隆位點(diǎn)上，陽性菌落接入LB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，取陽性菌液送公司測序，經(jīng)比對序列正確。

圖1 PCR擴(kuò)增三個甲基轉(zhuǎn)移酶基因Fig. 1 PCR amplification of three methyltransferase genes注：M為2K Marker；1-1和1-2為Si4′OMT；2-1和2-2為Si6OMT1；3-1和3-2為Si6OMT2

圖2 陽性單克隆的菌落PCR鑒定Fig. 2 PCR identification of positive monoclonal colonies注：M為2K Marker；1-1至1-5為Si4′OMT；2-1至2-5為Si6OMT1；3-1至3-5為Si6OMT2

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 氨基酸序列的比對

Si4′OMT基因編碼的氨基酸序列與其他植物來源的氨基酸序列的同源性達(dá)到60%～70%；Si6OMT1基因編碼的氨基酸序列與蓮花(Nelumbonucifera)的氨基酸序列相似性最高，可達(dá)到72.97%；Si6OMT2基因編碼的氨基酸序列與其他植物來源的氨基酸序列的同源性較低，僅達(dá)到50%～60%，結(jié)果見表4、表5和表6。經(jīng)蛋白保守域分析可知，3個O-甲基轉(zhuǎn)移酶都含有二聚化結(jié)構(gòu)域，屬于S-腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶超家族(S-adenosylmethionine(AdoMet or SAM)-dependent methyltransferase superfamily, AdoMet_MTases superfamily)。

表4 Si4′OMT與不同植物4'OMT氨基酸的同源性比對Table 4 Homology comparison of amino acids betweenSi4′OMT and 4'OMT in different plants

表5 Si6OMT1與不同植物6OMT氨基酸的同源性比對Table 5 Homology comparison of amino acids betweenSi6OMT1 and 6OMT in different plants

表6 Si6OMT2與不同植物6OMT氨基酸的同源性比對Table 6 Homology comparison of amino acids betweenSi6OMT2 and 6OMT in different plants

2.3.2 蛋白理化性質(zhì)的分析

為進(jìn)一步研究3個O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的功能提供理論依據(jù)，采用EXPASY在線工具對Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2的基本性質(zhì)進(jìn)行分析(表7)。Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2中只有Si6OMT1穩(wěn)定；經(jīng)過親水性分析，Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2的GRAVY值均為負(fù)值，即3個蛋白均為親水性蛋白；通過跨膜分析可知，Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2都沒有跨膜區(qū)。

表7 三個甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)序列的基本特性Table 7 The basic properties of the proteinsequence of three methyltransferases

2.3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析

通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹可以發(fā)現(xiàn)，Si4′OMT形成獨(dú)立的進(jìn)化分支，Si6OMT1與來自于S.tetrandra的St6OMT2聚類成同一個進(jìn)化支。Si6OMT2與來源于S.tetrandra的St6OMT4聚類成同一個進(jìn)化支，結(jié)果如圖3。

圖3 甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of methyltransferases注：黑色圓圈標(biāo)記為克隆的3個O-甲基轉(zhuǎn)移酶，每個進(jìn)化枝的自舉頻率基于1 000次迭代。

2.4 工程菌株的誘導(dǎo)與表達(dá)

將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行蛋白表達(dá)，由于重組蛋白融合了GST標(biāo)簽，重組后實(shí)際蛋白大小應(yīng)加上GST標(biāo)簽的分子量(約26 KDa)。通過計(jì)算，Si4′OMT、Si6OMT1、Si6OMT2的蛋白分子量分別約為61.0 KDa、63.9 KDa、65.7 KDa。與空載體蛋白對照相比，3個蛋白的上清部分有明顯的條帶(如箭頭所指)，說明3個蛋白形成可溶性表達(dá)(圖4)。

3 討論與結(jié)論

前期研究發(fā)現(xiàn)6OMT催化的反應(yīng)是生物堿合成過程中的關(guān)鍵限速步驟之一[17-18]，將源于日本黃連的6OMT基因?qū)爰又堇浰谂囵B(yǎng)細(xì)胞中，過表達(dá)6OMT的培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的生物堿平均含量是野生型細(xì)胞的7.5倍[17]。4′OMT也是BIAs生物合成的關(guān)鍵酶，過表達(dá)日本黃連中4′OMT基因，使小檗堿的產(chǎn)量增加1.5倍[19]。最近的研究顯示，可從黃連(Coptischinensis)[20]、粉防己(Stephaniatetrandra)[18]等植物中克隆獲得6OMT基因，從蓮花(Nelumbonucifera)[21]中克隆獲得4′OMT基因，為研究BIAs合成途徑及異源合成提供材料。

圖4 重組蛋白SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig. 4 Results of recombinant protein in SDS-PAGE注：M為marker；泳道1為pGEX-6P-1(載體對照)沉淀；泳道2為pGEX-6P-1(載體對照)上清；泳道3為Si4′OMT沉淀；泳道4為Si4′OMT上清；泳道5為Si6OMT1沉淀；泳道6為Si6OMT1上清；泳道7為Si6OMT2沉淀；泳道8為Si6OMT2上清

O-甲基轉(zhuǎn)移酶參與BIAs類生物堿生物合成的后修飾，生物堿結(jié)構(gòu)上加甲基會對其化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生重要影響，從而改變其生物活性。河谷地不容中含豐富的BIAs類活性成分，塊根和葉中基本涵蓋四氫原小檗堿類生物堿生物合成的主要中間體，且四氫巴馬汀和紫堇達(dá)明的含量相比于同科屬其他藥用植物高[6]，推測河谷地不容中可能存在高活性的O-甲基轉(zhuǎn)移酶，因此對其合成通路中的酶進(jìn)行解析有重要意義。

以河谷地不容為材料，克隆獲得3個O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2，分別編碼311、343、354個氨基酸，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，3個基因都含有二聚化結(jié)構(gòu)域，屬于AdoMet_MTases超家族，且Si6OMT1蛋白相對于Si4′OMT和Si6OMT2更穩(wěn)定。Si6OMT1與來源于S.tetrandra的St6OMT2聚類成同一個分支，推測Si6OMT1可能與已報(bào)道的St6OMT2有類似的催化特性[18]。

將河谷地不容的3個O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因構(gòu)建至表達(dá)載體pGEX-6P-1，采用原核表達(dá)體系E.coliBL21(DE3)為宿主進(jìn)行表達(dá)可快速獲得目的蛋白，且操作簡單、外源基因表達(dá)產(chǎn)物的水平較高。表達(dá)載體選擇N端含有GST標(biāo)簽的質(zhì)粒pGEX-6P-1，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄后mRNA中5′端編碼GST標(biāo)簽的序列被首先翻譯，有效地避免了mRNA無法被核糖體識別和核糖體延伸阻礙的問題，有助于目的蛋白的表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，與空載體對照相比，蛋白上清液在目的片段大小處有條帶，說明3個蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)，這將為進(jìn)一步分析河谷地不容Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2轉(zhuǎn)錄因子的下游調(diào)控基因打下了基礎(chǔ)，為解析河谷地不容中BIAs合成途徑解析及異源合成積累科學(xué)數(shù)據(jù)。