臺(tái)喜生，楊蕊琪，常國(guó)華，高天鵬，陳映全

1． 蘭州城市學(xué)院 地理與環(huán)境工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2． 甘肅省礦區(qū)污染治理與生態(tài)修復(fù)工程研究中心，甘肅 蘭州 730070； 3． 西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065

植物內(nèi)生菌是指其生活史的一定階段生活在活體植物組織內(nèi)，又不引起植物明顯病害的微生物，是一類重要的微生物資源，近年來成為微生物資源研究的熱點(diǎn)之一[1]。已有研究表明，植物內(nèi)生菌能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物抗逆性，增強(qiáng)植物重金屬耐性[2-5]。植物內(nèi)生菌通過溶磷、活化重金屬、產(chǎn)吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、產(chǎn)嗜鐵素、分解乙烯合成前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-am-inocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC)，以及傳遞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等作用，提升植物修復(fù)重金屬污染的作用[6-8]。從宿主植物中分離內(nèi)生菌，回接宿主植物，能促進(jìn)其生長(zhǎng)，增強(qiáng)其對(duì)重金屬等污染物的富集能力[9]。關(guān)于植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展的綜述性報(bào)道已有很多，內(nèi)容涵蓋內(nèi)生菌的物種多樣性、宿主多樣性、作物促生、生物防治、生理活性物質(zhì)的醫(yī)療開發(fā)應(yīng)用等方面[10-15]。本文將針對(duì)礦區(qū)環(huán)境污染生物修復(fù)中植物及其內(nèi)生菌的相互作用展開綜述和討論，歸納該研究領(lǐng)域目前存在的不足，進(jìn)一步提出具有研究?jī)r(jià)值的關(guān)注點(diǎn)。

1 礦區(qū)植物內(nèi)生菌物種多樣性及群落組成

1.1 內(nèi)生細(xì)菌

礦區(qū)植物體內(nèi)廣泛分布著內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌和內(nèi)生真菌。劉軍生等[16]對(duì)秦嶺鉛鋅尾礦區(qū)內(nèi)優(yōu)勢(shì)植物杠柳和草木樨的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分離，篩選出具有較高鎘抗性的11株內(nèi)生細(xì)菌，進(jìn)行了16S rDNA序列分析，經(jīng)鑒定均為芽孢桿菌(Bacillussp.)。王義聰[3]以云南省瀾滄縣募乃鉛鋅礦區(qū)礦渣堆中自然生長(zhǎng)的三種優(yōu)勢(shì)植物蒙自榿木、紫莖澤蘭和藎草為研究對(duì)象，對(duì)其根內(nèi)生細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了調(diào)查，研究發(fā)現(xiàn)蒙自榿木與紫莖澤蘭混合群落中蒙自榿木的克隆文庫(kù)香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon index)為4.85，其中占比大于3%的屬有Bradyrhizobium(11.38%)，Methylibium(6.88%)，Niastella(3.17%)和Actinoplanes(3.17%)，變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，放線菌門次之；混合群落中紫莖澤蘭的克隆文庫(kù)Shannon指數(shù)為3.82，優(yōu)勢(shì)屬為CandidatusPhytoplasma(31.44%)和Sphingomonas(5.94%)，變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，柔膜菌門次之；紫莖澤蘭單優(yōu)群落的克隆文庫(kù)Shannon指數(shù)為3.63，優(yōu)勢(shì)屬為CandidatusPhytoplasma(39.74%)，柔膜菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，變形菌門次之；藎草單優(yōu)群落的克隆文庫(kù)Shannon指數(shù)為4.98，其中占比大于3%的屬有Rhizobium(5.90%)，Niastella(5.64%)和CandidatusPhytoplasma(3.08%)，變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，綠彎菌門次之。劉莉華[2]從鎘超富集植物龍葵體內(nèi)分離得到5株內(nèi)生細(xì)菌，分別為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)細(xì)菌，腸桿菌屬(Enterobactersp.)細(xì)菌，巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，克雷伯氏菌屬細(xì)菌Klebsiellatrevisan和貪噬菌屬細(xì)菌Variovoraxparadoxus。陳亮[17]對(duì)重金屬污染條件下超累積植物龍葵內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了解析，發(fā)現(xiàn)龍葵內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性豐富，其中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位的類群為變形菌門(Proteobacteria，61.93%)，其次為放線菌門(Actinobacteria，18.78%)，擬桿菌門(Bacteroidetes，12.18%)和厚壁菌門(Firmicutes，2.03%)，以及未被分類細(xì)菌(Unclassified bacteria，5.08%)，優(yōu)勢(shì)菌屬為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)和假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，在克隆文庫(kù)中的占比分別為24.37%和12.18%。在此研究中，也分離篩選出具有多種重金屬抗性的純培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌30株，通過16S rDNA序列鑒定，主要為微桿菌屬(Microbacteriumsp.)，芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)，黃桿菌屬(Flavobacteriumsp.)，金黃桿菌屬(Chryseobacteriumsp.)，土壤農(nóng)桿菌屬(Agrobacteriumsp.)，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)，假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，沙雷氏菌屬(Serratiasp.)以及短桿菌屬(Curtobacteriumsp.)的細(xì)菌。柳若霖[6]從金昌鎳銅礦區(qū)6種植物中分離得到44株內(nèi)生菌，多為植物內(nèi)生菌的常見屬，其中大部分歸于假單胞菌屬(Pseudomonassp.，占比22.5%)，芽孢桿菌屬(Bacillussp.，占比20%)及細(xì)小桿菌屬(Microbacteriumsp.，占比15%)，并且首次分離了Sphingbacteriumsp.屬的內(nèi)生菌，首次從高寒干旱地區(qū)分離出Sinomicrobiumsp.屬的內(nèi)生菌，前人僅從熱帶植物中分離得到過Sinomicrobiumsp.屬的內(nèi)生菌。陳誠(chéng)[18]研究發(fā)現(xiàn)，攀枝花礦區(qū)植物內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)豐富，包括蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.)，藤黃色桿菌屬(Luteibactersp.)，假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，芽單胞菌屬(Gemmatimonadetessp.)，腸桿菌屬(Pantoeasp.)，棲熱菌屬(Thermussp.)，丙酸菌屬(Propionibacteriumsp.)，紅球菌屬(Rhodococcussp.)等。

1.2 內(nèi)生放線菌

鄭有坤等[19]采用變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)及序列分析對(duì)四川漢源鉛鋅礦區(qū)蜈蚣草內(nèi)生放線菌的多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)鉛鋅礦區(qū)蜈蚣草內(nèi)生放線菌存在豐富的多樣性。DGGE條帶序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，鏈霉菌屬(Streptomycessp.)，假諾卡氏菌屬(Pseudonocardiasp.)，小單孢菌屬(Micromonosporasp.)和Xianggellasp.為蜈蚣草內(nèi)生放線菌的優(yōu)勢(shì)菌屬；擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsissp.)，小雙孢菌屬(Microbisporasp.)，馬杜拉放線菌(Actinomadurasp.)，弗蘭克氏菌屬(Frankiasp.)的放線菌，以及一些未培養(yǎng)放線菌也在蜈蚣草體內(nèi)存在。攀枝花礦區(qū)植物內(nèi)生放線菌包含鏈霉菌屬(Streptomycessp.)，諾卡氏菌屬(Nocardiasp.)，假諾卡氏菌屬(Pseudonocardiasp.)的放線菌，以及不可培養(yǎng)放線菌(Uncultured actinobacterium)。鏈霉菌屬的內(nèi)生放線菌種類各異，不可培養(yǎng)放線菌類群之間有一定差異，攀枝花礦區(qū)植物具有可待挖掘的內(nèi)生放線菌資源[18]。

1.3 內(nèi)生真菌

張春燕[21]以采自南京棲霞鉛鋅礦區(qū)的新鮮構(gòu)樹根、莖和葉為研究對(duì)象，通過組織分離法，共分離純化了47株內(nèi)生真菌。構(gòu)樹葉的內(nèi)生真菌分離率達(dá)到0.91，構(gòu)樹內(nèi)生真菌具有豐富的生物多樣性，是潛在的內(nèi)生真菌資源庫(kù)；對(duì)分離獲得的47株內(nèi)生真菌及前期已獲得的48株內(nèi)生真菌進(jìn)行重金屬鋅(Zn)、鉛(Pb)和銅(Cu)的耐受性研究，發(fā)現(xiàn)其中5株菌對(duì)重金屬的耐受性較好，在Zn濃度為200 mmol/L時(shí)仍能生長(zhǎng)，它們分別為Apiosporamontagnei，Arthriniumphaeospermum，Aspergillussp.，Stagonosporopsiscucurbitacearum和Eyronellaeaaustralis。鄭有坤等[22]采用傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)法對(duì)四川漢源鉛鋅礦區(qū)6種常見植物香根草、五節(jié)芒、蜈蚣草、一年蓬、星毛角柱花和曼陀羅進(jìn)行內(nèi)生真菌分離，根據(jù)菌落形態(tài)特征篩選了27株代表菌株。采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)指紋圖譜分析技術(shù)進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并在RAPD分析的基礎(chǔ)上測(cè)定了8株代表菌株的rDNA-ITS序列。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，8個(gè)代表菌株分別屬于鐮刀菌屬(Fusariumsp.)，青霉屬(Penicilliumsp.)，座囊菌綱(Dothideomycetes)，小不整球殼屬(Plectosphaerellasp.)，漆斑菌屬(Myrotheciumsp.)，格孢腔菌屬(Pleosporalessp.)，鏈格孢屬(Alternariasp.)和擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsissp.)8個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分支，說明鉛鋅礦區(qū)植物內(nèi)生真菌具有一定的多樣性。錢旭等[23]以江西龍南鉀礦區(qū)常見蕨類植物芒萁、狗脊、禾稈蹄蓋蕨、海金沙、華中鐵角蕨、井欄邊草和烏蕨等植物為材料，采用組織分離、形態(tài)學(xué)鑒定等方法，對(duì)其內(nèi)生真菌多樣性進(jìn)行了調(diào)查。從7種植物中共分離獲得377株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定377個(gè)菌株隸屬于鏈格孢屬、曲霉屬、枝孢菌屬和輪枝孢屬等25個(gè)屬。陳誠(chéng)[18]研究發(fā)現(xiàn)攀枝花礦區(qū)植物內(nèi)生真菌種類豐富，包括莖點(diǎn)霉屬(Phomasp.)，派倫屬(Peyronellaeasp.)，鏈格孢屬(Alternariasp.)，Chaunopycnissp.，鐮刀菌屬(Fusariumsp.)，枝孢屬(Cladosporiumsp.)，短柄霉屬(Aureobasidiumsp.)，曲霉屬(Aspergillussp.)和柄銹菌屬(Pucciniasp.)等[18]。

1.4 深色有隔內(nèi)生真菌

深色有隔內(nèi)生真菌(Dark septate endophytes，DSE)是一類定殖于植物根部的小型真菌，它們廣泛分布于各種生態(tài)系統(tǒng)中，特別是在受脅迫的寒旱環(huán)境中[24]。DSE與宿主植物的關(guān)系正如叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)與其宿主植物一樣，是一種共生關(guān)系。DSE主要促進(jìn)植物對(duì)磷的吸收，能提高植物形成叢枝菌根的比例，并促進(jìn)新根的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)植物對(duì)有機(jī)或無機(jī)態(tài)氮的吸收，在植物吸收礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和水分方面具有重要作用[25]。云南大學(xué)趙之偉教授團(tuán)隊(duì)對(duì)云南鉛鋅礦區(qū)植物根內(nèi)DSE給予了很高的關(guān)注度，獲得了較多的研究成果。梁昌聰?shù)萚25]對(duì)云南省會(huì)澤縣者海鎮(zhèn)廢棄鉛鋅礦區(qū)的17科21種植物的DSE進(jìn)行了調(diào)查，在13種植物的根內(nèi)發(fā)現(xiàn)了DSE，占調(diào)查植物的62%?？涤頪26]對(duì)云南瀾滄縣竹塘鄉(xiāng)募乃老廠鉛鋅礦尾礦地的19科24種植物DSE定殖的情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其中17種植物的根內(nèi)有DSE定殖，占調(diào)查植物的70.83%；紫莖澤蘭是該礦區(qū)的優(yōu)勢(shì)植物，普遍地被DSE定殖，自然感染率達(dá)了30.62%，屬于中高度感染。張杰[20]對(duì)云南瀾滄暮乃礦區(qū)的19科24種植物和個(gè)舊礦區(qū)的25科30種植物根內(nèi)DSE調(diào)查發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)礦區(qū)植物DSE的定殖率分別是70.83%和90.00%，其中優(yōu)勢(shì)植物全部被DSE定殖。上述三項(xiàng)研究均表明即使是重金屬污染脅迫的區(qū)域，DSE依然廣泛分布。張杰[20]從云南暮乃礦區(qū)12科14種110個(gè)植物樣本中分離得到40株DSE，從云南個(gè)舊礦區(qū)18科23種108個(gè)植物樣本根內(nèi)分離得到55株DSE，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法對(duì)分離獲得的菌株進(jìn)行鑒定，大部分菌株屬于子囊菌(Ascomycetes)，包括Phomasp.，Schizotheciumsp.，Exophialasp.，Lophiostomasp.，Thysanoreasp.，Cladophialophorasp.，Phialophorasp.，Phialocephalasp.，Leptodontidiumsp.，Leohumicolasp.，Pleosporalessp.和Pyrenochaetasp.。其中，枝孢霉屬(Cladosporiumsp.)是定殖于云南暮乃礦區(qū)植物根內(nèi)的優(yōu)勢(shì)DSE，而云南個(gè)舊礦區(qū)DSE的優(yōu)勢(shì)菌屬是Leptodontidiumsp.。崔洪亮[24]對(duì)云南募乃鉛鋅礦區(qū)內(nèi)自然生長(zhǎng)的蒙自榿木根內(nèi)DSE定殖情況進(jìn)行了調(diào)查，從蒙自榿木根內(nèi)分離得到了一批DSE菌株。采用分子生物學(xué)手段對(duì)這些菌株進(jìn)行了初步鑒定，其中大部分菌株屬于子囊菌(Ascomycetes)，包括Cladosporiumsp.，Exophialasp.，Cladophialophorasp.，Phialophorasp.，Leptodontidiumsp.和Paraphomasp.，此外還有一些菌株分類地位尚不明確；在已經(jīng)鑒定到屬的菌株中，優(yōu)勢(shì)屬為Phialophorasp.。張燕[27]對(duì)云南蘭坪-會(huì)澤鉛鋅礦區(qū)特殊生境中植物根內(nèi)的DSE定殖情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)DSE普遍定殖于該區(qū)域植物根內(nèi)；對(duì)分離菌株的分子生物學(xué)鑒定表明，分離自會(huì)澤礦區(qū)植物根內(nèi)的菌株以Exophilasp.和Phialophorasp.為主，蘭坪礦區(qū)植物根內(nèi)的DSE則以Phialophorasp.和Lophiostomasp.為主；這兩個(gè)區(qū)域植物根內(nèi)DSE的優(yōu)勢(shì)類群區(qū)別于西雙版納熱帶雨林植物根內(nèi)DSE的優(yōu)勢(shì)類群(Colletotrichumsp.，Ochroconissp.和Phomasp.)；DSE重金屬抗性研究表明大部分菌株對(duì)Pb、Zn和鎘(Cd)都具有一定的抗性，也不乏高抗菌株，為從重金屬污染區(qū)的DSE中發(fā)掘抗性基因提供了菌種資源。蔚杰等[28]從河北峰峰礦區(qū)冬青和構(gòu)樹根內(nèi)分離鑒定了8種DSE，Acrocalymmavagum，Scytalidiumlignicola，Nothophomaquercina，Cochlioboluslunatus，F(xiàn)usariumacuminatum，Neonectriaradicicola，Pyrenochaetopsisindica和Pleosporalessp.，優(yōu)勢(shì)種為Acrocalymmavagum，Scytalidiumlignicola和Fusariumacuminatum，分離頻率分別達(dá)到37.6%，17.43%和11.93%。

由表1金屬礦區(qū)植物內(nèi)生菌群落組成比較可知，金屬礦區(qū)植物內(nèi)生菌群落組成隨植物種類、礦區(qū)生境及重金屬污染類型的變化而差異明顯。內(nèi)生細(xì)菌定殖率較高者為變形菌門(Proteobacteria)細(xì)菌，主要有芽孢桿菌(Bacillussp.)和假單胞菌(Pseudomonassp.)；內(nèi)生放線菌的主要類群為鏈霉菌(Streptomycessp.)；內(nèi)生真菌中鏈格孢屬(Alternariasp.)和曲霉屬(Aspergillussp.)分布較廣；DSE定殖率較高者為子囊菌門(Ascomycetes)真菌，其中瓶霉屬(Phialophorasp.)分布較廣。

2 礦區(qū)植物內(nèi)生菌生態(tài)分布規(guī)律

樊妙春[29]分析了鉛鋅礦區(qū)豆科植物刺槐與其根圍、根際、根內(nèi)和根瘤中微生物之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)在重金屬污染土壤中，微生物群落結(jié)構(gòu)主要取決于其所處生態(tài)位，來自根際土壤、根內(nèi)和根瘤的微生物類群會(huì)明顯的聚類。主成分分析顯示，生態(tài)位對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響有最大權(quán)重，污染程度的權(quán)重則較小；與根內(nèi)和根瘤中的微生物相比，污染程度對(duì)根際和根周土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)影響更大；

表1 金屬礦區(qū)植物內(nèi)生菌群落組成比較Table 1 Comparison of community composition of endophytes in metal mining areas

刺槐根內(nèi)和根瘤中微生物的定殖是一個(gè)生態(tài)位選擇的過程，植物可以選擇具有特定功能的微生物來占據(jù)根和根瘤的生態(tài)位，如根瘤中以固氮能力為主而根內(nèi)則有多種代謝功能，并且這兩個(gè)生態(tài)位對(duì)微生物的選擇過程是相對(duì)獨(dú)立的。而陳亮[17]通過對(duì)龍葵根和莖中內(nèi)生細(xì)菌克隆子序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析比較，發(fā)現(xiàn)龍葵根和莖中的內(nèi)生細(xì)菌種類存在差異，認(rèn)為不同的內(nèi)生細(xì)菌通過自身定殖能力主動(dòng)占據(jù)不同的生態(tài)位。因此，植物與其內(nèi)生菌之間的相互選擇理論存在主動(dòng)和被動(dòng)關(guān)系的差異，一種觀點(diǎn)認(rèn)為植物基于功能需求主動(dòng)選擇內(nèi)生菌，而另一種觀點(diǎn)認(rèn)為內(nèi)生菌通過競(jìng)爭(zhēng)主動(dòng)選擇植物體內(nèi)的生態(tài)位。也有研究認(rèn)為群落中不同植物之間對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的類群也有影響。王義聰[3]研究發(fā)現(xiàn)變形菌門在鉛鋅礦區(qū)礦渣堆單優(yōu)群落的紫莖澤蘭根內(nèi)并非最優(yōu)勢(shì)類群，而紫莖澤蘭與蒙自榿木混生之后，變形菌門成為最優(yōu)勢(shì)類群，可能是由于蒙自榿木與紫莖澤蘭相互影響所導(dǎo)致的。

研究普遍發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫導(dǎo)致植物內(nèi)生菌的多樣性下降。陳誠(chéng)[18]調(diào)查了攀枝花礦區(qū)四種常見植物牛筋草、紫莖澤蘭、劍麻和花蔓草內(nèi)生菌的物種多樣性，其中內(nèi)生細(xì)菌多樣性受Cu、Zn、砷(As)和鎳(Ni)的負(fù)向影響，內(nèi)生真菌多樣性受Ni和Cd的負(fù)向影響，內(nèi)生放線菌多樣性受鉻(Cr)、Cu、Cd、As和Ni的負(fù)向影響。鄭有坤等[19]研究發(fā)現(xiàn)鉛鋅礦區(qū)重金屬的累積影響了蜈蚣草內(nèi)生放線菌的分布，蜈蚣草內(nèi)生放線菌多樣性指數(shù)與Cu、Cd和Pb的含量之間存在顯著負(fù)相關(guān)。但是也有研究發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫的增加導(dǎo)致植物內(nèi)生菌多樣性增加[6]。陳亮[17]研究發(fā)現(xiàn)不同重金屬污染水平會(huì)導(dǎo)致龍葵體內(nèi)呈現(xiàn)不同的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成，隨著重金屬污染程度的加劇會(huì)使有的物種消失，但也會(huì)使一些有重金屬耐性的菌群呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。

重金屬脅迫之外的環(huán)境因子對(duì)植物與內(nèi)生菌相互關(guān)系的影響較為復(fù)雜。海金沙分布在不同鉀礦區(qū)，其內(nèi)生真菌出現(xiàn)頻率存在差異，各礦區(qū)內(nèi)生真菌群落之間的相似性低；鉀礦區(qū)海金沙內(nèi)生真菌出現(xiàn)頻率高于非鉀礦區(qū)；形成內(nèi)生真菌分布差異性與不同地理位置、氣候因素、土壤理化性質(zhì)和宿主植物組織的生理狀況以及化學(xué)組成變化等密切相關(guān)[30]。張杰[20]發(fā)現(xiàn)不同樣地分離的DSE的種類分布不同，這可能跟每個(gè)地區(qū)的植物種類分布不同有關(guān)，也可能受土壤重金屬含量及其他理化性質(zhì)的影響。崔洪亮[24]從蒙自榿木根內(nèi)分離得到了153株內(nèi)生真菌，分離自重金屬嚴(yán)重污染區(qū)域和輕度污染區(qū)域的DSE菌株中都存在Cd高抗和敏感菌株，但來自重度污染區(qū)的DSE菌株Cd抗性普遍高于輕度污染區(qū)的菌株。蔚杰等[28]研究了河北峰峰礦區(qū)DSE定殖及其群落組成，發(fā)現(xiàn)冬青和構(gòu)樹根系均能被DSE高度侵染，形成典型深色有隔菌絲和微菌核結(jié)構(gòu)。微菌核定殖率與土壤速效氮顯著負(fù)相關(guān)，菌絲定殖率與土壤全磷顯著正相關(guān)；總定殖率與土壤全磷顯著正相關(guān)，與重金屬Zn顯著負(fù)相關(guān)；定殖強(qiáng)度與土壤有機(jī)質(zhì)顯著負(fù)相關(guān)，與土壤全磷顯著正相關(guān)；同一植物不同樣地DSE群落組成差異顯著(P< 0.05)。

3 礦區(qū)植物與內(nèi)生菌互作機(jī)理研究

內(nèi)生菌與礦區(qū)植物相互作用的過程中，對(duì)植物的積極影響主要有促進(jìn)植物生長(zhǎng)，改善植物生長(zhǎng)環(huán)境，提高植物對(duì)脅迫的耐受性，提高植物在生境的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)等方面。劉軍生等[16]從秦嶺鉛鋅尾礦區(qū)內(nèi)優(yōu)勢(shì)植物杠柳和草木樨的內(nèi)生細(xì)菌中篩選出具有較高鎘抗性的11株內(nèi)生細(xì)菌，均具有鐵載體活性和ACC脫氨酶活性，其中7株內(nèi)生細(xì)菌有IAA活性。柳若霖[6]從金昌鎳銅礦區(qū)6種植物體內(nèi)分離得到44株內(nèi)生菌，篩選出18株對(duì)Cu和Ni抗性較高的菌株并測(cè)定其促生特性。其中，具備溶磷能力的有13株，所有菌株均可產(chǎn)生IAA，能夠代謝ACC的有3株，對(duì)Cu、Ni具有活化能力的各2株。IAA可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，鐵載體可以螯合重金屬改善植物生長(zhǎng)環(huán)境，ACC脫氨酶可以減少重金屬對(duì)植物的脅迫傷害而提高植物對(duì)脅迫的耐受性。陳亮[17]從生長(zhǎng)于重金屬礦區(qū)的超累積植物龍葵體內(nèi)分離篩選出功能內(nèi)生菌株。對(duì)龍葵幼苗的侵染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌株的單個(gè)功能特性與龍葵幼苗生長(zhǎng)參數(shù)之間并沒有明顯的相關(guān)性。但當(dāng)某菌株同時(shí)具備多種功能特性時(shí)則對(duì)幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育具有顯著的促進(jìn)作用，包括產(chǎn)IAA和鐵載體以及具有ACC脫氨酶能力、固氮和解磷能力；接種一株能同時(shí)產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)生表面活性劑和代謝產(chǎn)酸功能的內(nèi)生細(xì)菌Lk9能夠改善土壤中鐵和磷等礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的供應(yīng)，提高土壤中重金屬的生物可利用性，以及影響龍葵根系低分子量有機(jī)酸的分泌，顯著增加了龍葵地上部生物量(提高了14%)和重金屬的累積(Cd、Zn和Cu的累積量分別提高了46.6%，16.4%和16%)；在聯(lián)合修復(fù)過程中Lk9和龍葵的相互作用影響了土壤微生物性質(zhì)及功能，如提高了修復(fù)土壤的微生物量(如微生物量碳提高了39.2%)以及土壤酶活(如酸性磷酸酶活性提高了28.6%)，這對(duì)改善土壤肥力及其生態(tài)功能的恢復(fù)具有重要意義。

云南省瀾滄縣募乃鉛鋅礦區(qū)礦渣堆上自然生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)植物紫莖澤蘭依靠在體內(nèi)積累31.93%～40.39%當(dāng)?shù)夭≡?xì)菌CandidatusPhytoplasma來提高自身在當(dāng)?shù)氐母?jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，而在同一生境自然生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)植物蒙自榿木根內(nèi)(積累了1.32%)和藎草根內(nèi)(積累了3.08%)卻很少發(fā)現(xiàn)，成為入侵植物“積累當(dāng)?shù)夭≡⑸锛僬f”的例證之一[3]。康宇[26]研究發(fā)現(xiàn)接種DSE可提高盆栽的鉛鋅礦區(qū)優(yōu)勢(shì)植物紫莖澤蘭的超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)的活性，減小氧化損傷，從而增強(qiáng)其對(duì)Cd的抗性。DSE在植物根內(nèi)定殖，有可能通過菌絲體對(duì)金屬離子的固持作用緩解植物根圍土壤微環(huán)境中超量金屬離子對(duì)植物的毒害作用[31]。湛方棟[32]從重金屬嚴(yán)重污染的云南會(huì)澤鉛鋅礦區(qū)自然生長(zhǎng)的密序野古草根內(nèi)分離得到DSE嗜魚外瓶霉(ExophialapisciphilaACCC32496)，分析了E.pisciphila對(duì)Cd的富集特征和耐性機(jī)制，發(fā)現(xiàn)E.pisciphila對(duì)Cd的耐性機(jī)制包括胞外機(jī)制和胞內(nèi)機(jī)制。胞外機(jī)制有三個(gè)方面，一是增加低分子量有機(jī)酸尤其是草酸的分泌；二是通過菌絲細(xì)胞壁上氨基、酰氨基、羧基、羥基和磷?；然瘜W(xué)基團(tuán)對(duì)Cd進(jìn)行吸附；三是增加細(xì)胞壁上特殊組分黑色素的合成。胞內(nèi)機(jī)制有兩個(gè)方面，一是通過增強(qiáng)菌絲細(xì)胞內(nèi)SOD、過氧化氫酶(Catalase，CAT)等抗氧化酶的活性，及增加谷胱甘肽(Glutathione，GSH)等巰基化合物的合成，以抑制Cd脅迫下超氧陰離子、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和H2O2含量顯著增加造成的氧化損傷；二是提高菌絲中磷、硫、鎂和鈣等礦質(zhì)元素的含量，提高E.pisciphila對(duì)Cd的耐受能力。通過胞外和胞內(nèi)耐受、富集機(jī)制，DSE菌絲可以吸附、固定Cd，提高宿主植物耐受Cd的能力。

4 內(nèi)生菌在礦區(qū)污染植物修復(fù)中的應(yīng)用探索

早在2001年，馬彥卿[33]就通過對(duì)比研究提出，向新種植的植物接種固氮菌、磷細(xì)菌、鉀細(xì)菌和內(nèi)生菌等微生物，可使失去微生物活性的復(fù)墾礦區(qū)土壤重新建立和恢復(fù)土壤微生物體系，加速?gòu)?fù)墾土地土壤的基質(zhì)改良和植被重建。重建植被是解決金屬尾礦廢棄地環(huán)境問題的最佳選擇之一[26]。植物的生物量決定了植物對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)效率和修復(fù)效果[34]。大量關(guān)于內(nèi)生菌與植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染的研究表明，內(nèi)生菌不僅可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，還可以幫助植物提取土壤中的重金屬，進(jìn)而修復(fù)重金屬污染土壤[35]。劉莉華[2]從Cd超富集植物龍葵體內(nèi)分離得到5株內(nèi)生細(xì)菌N1、N2、N4、DE2和DE5，開展聯(lián)合盆栽試驗(yàn)。在龍葵根際土壤分別接入Cd抗性內(nèi)生菌N1、N2和N4，結(jié)果顯示接入內(nèi)生菌對(duì)Cd污染環(huán)境中龍葵的生長(zhǎng)和Cd富集具有明顯的促進(jìn)作用，且混和菌株效果優(yōu)于單菌株，差異顯著。陳亮[17]將篩選的具有促生功能的內(nèi)生菌再接種龍葵提高了其修復(fù)Cd污染土壤的效率，在緩解Cd脅迫增加龍葵生物量的同時(shí)也促進(jìn)了龍葵對(duì)Cd的吸收。王璐[34]從蘇丹草體內(nèi)篩選到一株具有Cu抗性的內(nèi)生促生細(xì)菌EnterobacteraerogenesK3-2，通過盆栽試驗(yàn)研究不同Cu污染水平下K3-2對(duì)蘇丹草生長(zhǎng)和富集Cu的影響。結(jié)果表明，K3-2能顯著促進(jìn)蘇丹草的生長(zhǎng)，活化土壤中的Cu，強(qiáng)化蘇丹草對(duì)Cu的吸收?？涤頪26]從云南瀾滄縣竹塘鄉(xiāng)募乃老廠鉛鋅礦尾礦地自然生長(zhǎng)的植物體內(nèi)分離獲得一株DSE H84-1，分子生物學(xué)技術(shù)鑒定為嗜魚外瓶霉(Exophialapisciphila)，在純培養(yǎng)條件下其對(duì)Cd表現(xiàn)出較高的耐性；在Cd脅迫下用H84-1接種盆栽紫莖澤蘭，DSE能在紫莖澤蘭根系上成功定殖，DSE的侵染程度隨著Cd濃度的升高而增大；Cd污染對(duì)紫莖澤蘭的生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)向影響，隨基質(zhì)中Cd濃度增加，紫莖澤蘭生物量下降，接種DSE并不能改變這種趨勢(shì)，而與對(duì)照相比，接種DSE能增加紫莖澤蘭地上和地下部分生物量；無論接種與否，紫莖澤蘭吸收Cd后主要在根部積累，而且隨基質(zhì)中Cd濃度的增加，紫莖澤蘭地上和地下部分Cd濃度也隨之增加。與對(duì)照相比，接種DSE增加了紫莖澤蘭吸收Cd的趨勢(shì)；接種DSE能夠顯著增強(qiáng)紫莖澤蘭對(duì)Cd的富集能力，其富集系數(shù)是對(duì)照的兩倍多。張杰[20]在不同濃度Cd脅迫下給玉米接種分離自重金屬礦區(qū)的DSE菌株Cladosporiumsp. z113。z113表現(xiàn)出良好的接種效應(yīng)，提高了玉米的生物量，并增強(qiáng)了其對(duì)重金屬的耐性，把重金屬固持在玉米根部從而減輕玉米植株受重金屬毒害，降低了玉米對(duì)重金屬的吸收。

此外，從礦區(qū)植物體內(nèi)分離獲得內(nèi)生菌應(yīng)用于作物促生的研究亦有報(bào)道。詹壽發(fā)等[36]從鉀礦區(qū)優(yōu)勢(shì)蕨類植物芒萁內(nèi)生真菌中篩選出具溶磷、解鉀、分泌IAA功能的菌株泡盛曲霉(Aspergillusawamori)和黑曲霉(Aspergillusniger)，并采用回接及盆栽試驗(yàn)研究它們對(duì)玉米幼苗的促生作用，發(fā)現(xiàn)回接內(nèi)生菌株能有效提高玉米植株體內(nèi)葉綠素及磷和鉀的含量，對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。劉軍生等[16]從秦嶺鉛鋅尾礦區(qū)內(nèi)優(yōu)勢(shì)植物杠柳內(nèi)生細(xì)菌中篩選出Cd去除率最高，IAA、鐵載體和ACC脫氨酶活性最佳的菌株GR44，在小麥盆栽試驗(yàn)中能顯著提高小麥幼苗的耐鎘能力(P< 0.05)。任麗婷[35]從金昌鎳銅礦區(qū)植物體內(nèi)分離出的內(nèi)生細(xì)菌N1(泛菌屬)和W1(假單胞菌屬)，以及兩者的混合菌液，均可以促進(jìn)重金屬?gòu)?fù)合污染土壤中油葵的生長(zhǎng)發(fā)育，提高油葵的重金屬耐受性，強(qiáng)化油葵對(duì)重金屬的富集及轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

5 礦區(qū)植物內(nèi)生菌研究結(jié)論

金屬礦區(qū)植物內(nèi)生菌群落組成隨植物種類、礦區(qū)生境及重金屬污染類型的變化而差異明顯。內(nèi)生細(xì)菌定殖率較高者為變形菌門(Proteobacteria)細(xì)菌，主要有芽孢桿菌(Bacillussp.)和假單胞菌(Pseudomonassp.)；內(nèi)生放線菌的主要類群為鏈霉菌(Streptomycessp.)；內(nèi)生真菌中鏈格孢屬(Alternariasp.)和曲霉屬(Aspergillussp.)分布較廣；DSE定殖率較高者為子囊菌門(Ascomycetes)真菌，其中瓶霉屬(Phialophorasp.)分布較廣。研究發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫導(dǎo)致植物內(nèi)生菌的多樣性下降，重金屬脅迫之外的環(huán)境因子對(duì)植物與內(nèi)生菌相互關(guān)系的影響較為復(fù)雜。內(nèi)生菌與礦區(qū)植物相互作用的過程中，對(duì)植物的積極影響主要有促進(jìn)植物生長(zhǎng)，改善植物生長(zhǎng)環(huán)境，提高植物對(duì)脅迫的耐受性，提高植物在生境的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)等方面。

6 礦區(qū)植物內(nèi)生菌資源研究的不足及展望

相對(duì)于礦區(qū)植物內(nèi)生真菌，內(nèi)生細(xì)菌的研究相對(duì)較少，獨(dú)立地對(duì)內(nèi)生放線菌類群進(jìn)行調(diào)查分析的最少。但是，內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌與內(nèi)生真菌一樣，均具有潛在的植物促生和植物修復(fù)輔助價(jià)值，值得給予更多的關(guān)注。

從礦物植物體內(nèi)分離內(nèi)生菌株回接(反接或回殖)及盆栽試驗(yàn)研究較多，但真正應(yīng)用于礦區(qū)植物修復(fù)的原位試驗(yàn)很少，尚未形成有效的技術(shù)手段和操作模式，是未來礦區(qū)植物內(nèi)生菌研究和應(yīng)用中有廣闊前景的發(fā)展方向。

內(nèi)生菌耐受功能基因、降解功能基因、轉(zhuǎn)化污染物功能基因及促生功能基因的發(fā)掘，及其在植物體內(nèi)的有效轉(zhuǎn)化和在植物修復(fù)中的應(yīng)用研究仍然很少，內(nèi)生菌功能基因克隆及其轉(zhuǎn)化植物有望成為礦區(qū)植物內(nèi)生菌資源開發(fā)研究新的生長(zhǎng)點(diǎn)。因?yàn)閮?nèi)生菌長(zhǎng)期生活在植物體內(nèi)，能夠在植物體內(nèi)穩(wěn)定的生長(zhǎng)和進(jìn)行代謝活動(dòng)，因此內(nèi)生菌可以作為礦區(qū)植物細(xì)胞和分子水平改造，用于生物修復(fù)和生物防治等生物工程操作技術(shù)中外源基因的載體。

礦區(qū)及其自然生長(zhǎng)的植物作為特殊生境和特殊宿主，蘊(yùn)含的內(nèi)生菌資源必然有特殊的生理生態(tài)功能、代謝途徑和生理活性代謝產(chǎn)物，其在生物防治和藥物開發(fā)方面的潛力還有待挖掘。