王遠(yuǎn)萍，唐濤，吳艷秋，王國(guó)鑌

摘要：根據(jù)GenBank上雞白介素15（IL-15），白介素16（IL-16），白介素18（IL-18）基因的序列，在保守區(qū)設(shè)計(jì)并合成各自特異引物，并以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用SYBR Green I染料法建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。將基因克隆至pMD19-T載體上，以各陽(yáng)性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行了熔解曲線分析。結(jié)果表明，雞IL-15、IL-16、IL-18和β-actin基因的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度在2×102～2×108copies/μL范圍分別呈良好的線性關(guān)系，r2均大于0.999。熔解曲線分析表明，產(chǎn)物為特異的單峰。建立的雞IL-15、IL-16和IL-18基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)周期短，為在mRNA水平對(duì)雞白介素的定量分析奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光定量PCR；雞；IL-15；IL-16；IL-18

細(xì)胞因子是多種細(xì)胞所分泌能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化、調(diào)節(jié)免疫功能、參與炎癥發(fā)生和創(chuàng)傷愈合等小分子多肽的統(tǒng)稱(chēng)[1]。對(duì)于人細(xì)胞因子已經(jīng)有較廣泛的研究，現(xiàn)已有大量純化的細(xì)胞因子在臨床上用于治療多種疾病，禽細(xì)胞因子的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于人細(xì)胞因子的研究[2]。近年來(lái)，人們主要是研究雞細(xì)胞因子的佐劑效應(yīng)，很少研究細(xì)胞因子差異表達(dá)與疾病之間的關(guān)系。本研究主要是建立一種檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)的快速靈敏的方法，為細(xì)胞因子差異表達(dá)與疾病之間關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物、菌種和質(zhì)粒

試驗(yàn)動(dòng)物為21日齡非免疫雞，DH5α基因工程菌株，pMD19-T載體。

1.2主要儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，普通PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)，電泳儀，核酸蛋白測(cè)定儀，高速冷凍離心機(jī)，超凈工作臺(tái)，電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.3主要試劑

TRNzol-A+總RNA提取試劑，Master Mix，Real MasterMix SYBR GreenⅠ，質(zhì)粒小量提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄酶Prime Script，PCR產(chǎn)物回收試劑盒。

1.4引物的設(shè)計(jì)及合成

參照GenBank上登錄的細(xì)胞因子IL-15、IL-16、IL-18以及β-actin的核酸序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。引物序列見(jiàn)表1。

1.5 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR及熔解曲線的繪制

采用SYBR Green I染料法，在Bio-Rad iCyclerQ5熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析[3]。PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板1μL，2.5×RealMasterMix/20×SYBR solution 9μL，上游引物終濃度為0.2μmol/L，下游引物終濃度為0.2μmol/L；補(bǔ)足超純水至20μL。PCR反應(yīng)程序如下：①95℃預(yù)變性1min；②95℃變性15s，55.0℃復(fù)性25s，延伸10s；反應(yīng)45循環(huán)。PCR儀于延伸階段采集熒光信號(hào)；③95℃變性3min，50℃復(fù)性3min；④65℃起始至95℃停止梯度升溫繪制熔解曲線，每梯度上升0.5℃，每梯度采集熒光信號(hào)一次。繪制溶解曲線進(jìn)行特異性分析。

1.7循環(huán)條件的優(yōu)化

溫度條件的優(yōu)化：分別使用64.0、63.1、61.5、58.9、55.3、52.8、51.1和50.0℃八個(gè)溫度梯度對(duì)Real-time PCR反應(yīng)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。

引物濃度的優(yōu)化：分別使用終濃度0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3μmol/L六個(gè)引物濃度梯度對(duì)Real-time PCR反應(yīng)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)過(guò)后通過(guò)Ct值的大小以及熔解曲線的特異性判斷最佳退火溫度以及最適宜引物濃度[4]。

1.8標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將IL-15、IL-16、IL-18以及β-actin PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，回收的片段與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性克隆。將測(cè)序鑒定正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋100倍后，使用核酸蛋白測(cè)定儀Bio-Rad Smartspec3000進(jìn)行質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品OD260的測(cè)定，并根據(jù)公式轉(zhuǎn)化為測(cè)定樣品中的質(zhì)?？截悢?shù)。將濃度為2×108的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?個(gè)梯度，拷貝數(shù)范圍為2×108～2×103copies/μL。每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)平行，在優(yōu)化好的反應(yīng)條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)各稀釋度Ct值得出檢測(cè)范圍，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2結(jié)果

2.1特異性分析

根據(jù)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳（見(jiàn)圖1）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線分析表明，PCR擴(kuò)增特異性很強(qiáng)，只有1個(gè)特異性峰，無(wú)引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。PCR擴(kuò)增的目的條帶長(zhǎng)度符合預(yù)期大小。

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化條件

退火溫度及引物濃度的優(yōu)化結(jié)果顯示，用表2中的PCR反應(yīng)條件，具有最低的Ct值及最高的熒光強(qiáng)度，且無(wú)引物二聚體形成。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將各細(xì)胞因子陽(yáng)性質(zhì)粒按體積比1：10倍比稀釋后作為PCR定量模板，根據(jù)各稀釋度Ct值得出檢測(cè)范圍，并繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，該方法具有良好的敏感性，檢測(cè)下限均為2×102copies/μL，且Ct值與其濃度在2×108～2×102copies/μL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r2>0.999。

3討論

有關(guān)細(xì)胞因子方面的研究已成為當(dāng)今基礎(chǔ)免疫學(xué)和臨床免疫學(xué)研究中十分活躍的領(lǐng)域，并取得了令人矚目的成績(jī)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR是檢測(cè)微量mRNA較準(zhǔn)確的方法，特異性和敏感性高，故本試驗(yàn)選擇此方法。由于提取RNA的質(zhì)量差異以及反轉(zhuǎn)率效率上的差異，因此應(yīng)選擇內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[5]。β-actin基因序列高度保守，mRNA表達(dá)數(shù)量高，能在不同的組織細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。故本文選擇β-actin作為建立檢測(cè)細(xì)胞因子基因的內(nèi)參基因。本文建立的雞IL-15、IL-16和IL-18基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)周期短，為在mRNA水平對(duì)雞白介素的定量分析奠定了基礎(chǔ)。█

參考文獻(xiàn)：

[1]劉英姿，羅有梁，周鐵忠.原花青素A-1調(diào)節(jié)ConA刺激小鼠脾細(xì)胞分泌Th1/Th2細(xì)胞因子的影響[J].免疫學(xué)雜志，2012，28 （11）： 942-945.

[2]陶新，汪以真.細(xì)胞因子在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的研究進(jìn)展[J].飼料研究，2001（7）：12-13+11.

[3]張賀楠，賴(lài)漢漳，齊巖，等.雞IFN-α和IFN-β及IFN-γ基因?qū)崟r(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2009，39（2）： 173-177.

[4]劉溫泉.新城疫F48E9毒株與Lasota毒株感染雞后外周血部分細(xì)胞因子差異表達(dá)的研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[5]王玉林，史進(jìn)方，蔡惠芬，等.內(nèi)參基因β-actin質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（48）：9501-9504.