王 帆,楊 燕,官 悅,陳楊武,譚周亮,鄧欽文

(1.南華大學(xué) 資源環(huán)境與安全工程學(xué)院,湖南 衡陽(yáng) 421001;2.中國(guó)科學(xué)院 環(huán)境與應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041;3.南華大學(xué) 衡陽(yáng)市土壤污染控制與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 衡陽(yáng) 421001;4.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院,北京 100193)

0 引 言

抗生素已廣泛用于預(yù)防和治療人類及獸類的各種疾病，甚至被用作飼料添加劑以促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng)[1-3]。中國(guó)是世界上最大的抗生素生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)之一，2013年中國(guó)消費(fèi)了92 700 t抗生素，包括36種抗生素，其中人類消費(fèi)占48%，動(dòng)物消費(fèi)占52%，人均消費(fèi)量超過(guò)英國(guó)和北歐大部分地區(qū)的使用量6倍之多[4-5]。大量使用的抗生素并不能完全被機(jī)體吸收，約有70%以活性母體化學(xué)物質(zhì)或代謝產(chǎn)物排出，可通過(guò)多種途徑進(jìn)入水環(huán)境[6-8]。近年來(lái)抗生素在全球范圍內(nèi)的污水處理廠被廣泛檢出，污水處理廠已成為抗生素的一個(gè)主要污染匯，其濃度多數(shù)在ng/L～μg/L級(jí)別。然而，污水處理工藝并不能完全去除抗生素[9-15]。環(huán)境中抗生素的長(zhǎng)期存在會(huì)誘導(dǎo)耐藥菌和耐藥基因大范圍的增殖和傳播，進(jìn)而對(duì)人類健康產(chǎn)生潛在的威脅[16-18]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于環(huán)境樣品中抗生素的檢測(cè)尚未有統(tǒng)一的方法標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有的檢測(cè)方法包括高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS)和超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)等[19-24]。其中，UPLC-MS/MS的靈敏度高、選擇性好，對(duì)環(huán)境樣品中痕量抗生素的檢測(cè)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[22,25-26]。須指出的是，為實(shí)現(xiàn)環(huán)境樣品抗生素的有效測(cè)定，探索合適的樣品前處理?xiàng)l件十分關(guān)鍵。通常，水相樣品前處理方法為固相萃取法(solid phase extraction，SPE)，固相樣品前處理方法為超聲溶劑萃取-固相萃取法(ultrasonic solvent extraction-solid phase extraction，USE-SPE)[19-20,22,27]。由于環(huán)境樣品中抗生素種類繁多且理化性質(zhì)差異較大、不同環(huán)境基質(zhì)復(fù)雜程度不一，針對(duì)不同環(huán)境樣品優(yōu)化其前處理?xiàng)l件對(duì)于抗生素的準(zhǔn)確測(cè)定至關(guān)重要。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在地表水、自來(lái)水、污廢水等環(huán)境基質(zhì)中抗生素的檢測(cè)方法開(kāi)發(fā)方面開(kāi)展了大量工作，并取得了較好的應(yīng)用效果，但目前仍存在分離效果較差或相對(duì)耗時(shí)較長(zhǎng)等問(wèn)題，同時(shí)針對(duì)市政污泥等更為復(fù)雜的環(huán)境介質(zhì)中抗生素的檢測(cè)方法研究還較為缺乏[14,21,26-30]。因此，建立一種同步測(cè)定市政污水廠污水和污泥中多類抗生素的分析方法是十分必要的。

本文以污水處理系統(tǒng)中檢出率較高的4大類包括4種四環(huán)素類(tetracyclines，TCs)、5種磺胺類(sulfonamides，SAs)、4種喹諾酮類(quinolones，QNs)和2種大環(huán)內(nèi)酯類(macrolides，MLs)共15種典型抗生素為目標(biāo)抗生素，采用USE/SPE-UPLC-MS/MS技術(shù)，著重優(yōu)化了儀器分析參數(shù)和樣品前處理方法，建立了一種適用于市政污水廠污水和污泥中4類15種典型抗生素的同步測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀(ACQUITY UPLC，美國(guó)Waters公司)，配三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Xevo TQ MS，美國(guó)Waters公司)；固相萃取儀(12管防交叉污染型，美國(guó)Supelco公司)；氮吹儀(HGC-12D，天津市恒奧科技公司)；真空冷凍干燥機(jī)(SCIENTZ-12N，寧波新芝生物科技股份有限公司)；高速離心機(jī)(TDL-5-A，上海安亭科學(xué)儀器廠)；超聲波清洗機(jī)(AS3120，天津奧特賽恩斯儀器公司)；渦旋混勻器(Vortex 2，德國(guó)IKA公司)；超純水器(UPT-II-10L，成都優(yōu)越科技有限公司)；固相萃取小柱(Oasis HLB 6 mL/500 mg，美國(guó)Waters公司)。

15種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品包括4種TCs：強(qiáng)力霉素(doxycycline，DOX)、四環(huán)素(tetracycline，TC)、金霉素(chlortetracycline，CTC)、土霉素(oxytetracycline, OTC)；5種SAs：磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine，SM2)、磺胺嘧啶(sulfadiazine，SDZ)、磺胺甲嘧啶(sulfamerazine，SM1)、磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine, SMM)、磺胺氯噠嗪(sulfachloropyridazine, SCP)；4種QNs：環(huán)丙沙星(ciprofloxacin, CIP)、諾氟沙星(norfloxacin，NOR)、氧氟沙星(ofloxacin, OFL)、恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)；2種MLs：羅紅霉素(roxithromycin, ROX)、阿奇霉素(azithromycin, AZM)，以上均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度均大于99.5%。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯和甲酸均為色譜純級(jí)；Na2EDTA、氫氧化鈉、硝酸鎂、氨水、檸檬酸、磷酸氫二鈉和磷酸等均為分析純級(jí)。

1.2 溶液配制

精確稱取5.0 mg各抗生素標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇中，將其轉(zhuǎn)移至100.0 mL棕色容量瓶中定容并搖勻，配制成50.0 mg/L的抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于-20 ℃下避光保存。精密吸取各抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液4 mL至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋定容并搖勻，配制成2.0 mg/L的抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于-20 ℃下避光保存。使用時(shí)，用體積分?jǐn)?shù)為20%的甲醇溶液稀釋至所需濃度。

1.3 樣品采集與前處理

2020年5月，采集了四川省資陽(yáng)市某污水處理廠進(jìn)出水及生化池泥水混合液樣品6個(gè)，每個(gè)取樣點(diǎn)采集2 L水樣裝入棕色采樣瓶中，在冰浴下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并于4 ℃下保存，48 h內(nèi)完成前處理。

污水樣品：水樣經(jīng)0.45 μm玻璃纖維濾膜過(guò)濾后，準(zhǔn)確量取500 mL，加入0.25 g Na2EDTA，混勻，(絡(luò)合水樣中的金屬陽(yáng)離子等)，然后用H3PO4調(diào)節(jié)pH至3.0左右，儲(chǔ)存于4 ℃下并在48 h內(nèi)完成固相萃取。依次用10 mL甲醇、10 mL超純水、10 mL pH=3的超純水活化HLB小柱。將預(yù)處理后的水樣以3 mL/min左右的流速通過(guò)HLB小柱進(jìn)行富集；完成過(guò)柱后，用10 mL超純水淋洗HLB小柱以去除雜質(zhì)；真空干燥2 h左右，再用9 mL體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸-甲醇溶液洗脫，洗脫液用10 mL的氮吹管收集，且保持洗脫流速為1 mL/min左右；將收集的洗脫液在35 ℃下用溫和的氮?dú)獯抵?.1 mL左右，用體積分?jǐn)?shù)為20%的甲醇溶液復(fù)溶至1 mL，渦旋振蕩2～3 min，用0.22 μm針孔濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至1.5 mL棕色瓶中儲(chǔ)存于-20 ℃下，待UPLC-MS/MS分析。

污泥樣品：將采集的污泥樣品于-20 ℃下冷凍一周左右，經(jīng)48 h冷凍干燥后研磨過(guò)篩，準(zhǔn)確稱取1.0 g過(guò)篩后的污泥樣品于50 mL的聚四氟乙烯離心管中，加入15 mL體積比為1∶1的McIlvaine緩沖液和乙腈溶液，渦旋震蕩2 min，超聲15 min，5 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至棕色玻璃瓶中，重復(fù)萃取2次；再向殘余物中加入5 mL體積比為96∶4的Mg(NO3)2和NH3·H2O溶液繼續(xù)萃取，步驟同上，重復(fù)萃取2次；合并萃取液，用超純水稀釋至500 mL，隨后進(jìn)行固相萃取，步驟與污水樣品的處理相同。

1.4 分析條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫程序：0 min，10% B；8 min，12% B；10.5 min，18% B；15 min，540% B；17 min，55% B；17 min，90% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(electrospray ion source，ESI)，正離子模式；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：500 ℃，脫溶劑氣流量：800 L/h；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；錐孔電壓：35 V；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)模式檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[26-27,31]，4大類目標(biāo)抗生素在ESI正離子模式下掃描，采用MRM模式時(shí)響應(yīng)較強(qiáng)。因此，本文選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)ESI+模式監(jiān)測(cè)。將15種50 μg/L目標(biāo)抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入離子源，在ESI+模式下進(jìn)行離子掃描，選取響應(yīng)最高的離子峰作為該化合物的母離子，然后對(duì)母離子進(jìn)行破碎，選擇2個(gè)合適的碎片離子作為子離子，并對(duì)各目標(biāo)抗生素的子母離子對(duì)進(jìn)行碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。15種目標(biāo)抗生素在MRM模式下的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 MRM模式下15種目標(biāo)抗生素的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Mass spectrometry acquisition parameters for the 15 target antibiotics in MRM mode

2.2 色譜分離程序的優(yōu)化

對(duì)于抗生素等藥物類化合物常用乙腈、甲醇和含無(wú)機(jī)酸的水溶液組成的流動(dòng)相體系進(jìn)行分離，如甲酸和氨水等離子化助劑可以有效改善目標(biāo)抗生素的峰形、提高分析靈敏度[25,29,32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸可以顯著改善目標(biāo)抗生素的峰形。因此，本文采用體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸-水和乙腈溶液作為二元流動(dòng)相體系對(duì)目標(biāo)抗生素進(jìn)行梯度洗脫分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15種目標(biāo)抗生素均可以得到較高的響應(yīng)值，但是有部分抗生素的響應(yīng)峰存在重疊，分離效果不理想。為了使15種目標(biāo)抗生素均可被有效分離，對(duì)流動(dòng)相洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定梯度洗脫程序?yàn)椋? min，10% B；8 min，12% B；10.5 min，18% B；15 min，540% B；17 min，55% B；17 min，90% B?？傠x子流色譜圖如圖1所示，分離效果較好，無(wú)明顯峰形拖尾。

1—SD；2—SM1；3—SM2；4—OTC；5—NOR；6—OFL；7—CIP；8—TC；9—SMM；10—SCP；11—ENR；12—CTC；13—AZM；14—DOX；15—ROX。圖1 15種目標(biāo)抗生素的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current(TIC)chromatogram of the 15 target antibiotics

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

固相萃取(solid phase extraction，SPE)和超聲溶劑萃取(ultrasonic solvent extraction，USE)技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境樣品中抗生素類化合物的前處理[19-20,22,32]。因此，本文采用SPE和USE技術(shù)對(duì)污水和污泥樣品中抗生素進(jìn)行提取、富集和凈化，為減少環(huán)境基質(zhì)的干擾同時(shí)提高目標(biāo)抗生素的回收率，需對(duì)SPE洗脫劑和USE提取劑進(jìn)行優(yōu)化。

已報(bào)道的研究中大多選擇用甲醇作為目標(biāo)分析物的洗脫劑[28,34]，本文對(duì)比了洗脫劑A：體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸-甲醇溶液、洗脫劑B：體積比為1∶1的甲醇-乙腈、洗脫劑C：體積分?jǐn)?shù)為2%氨水-甲醇溶液和洗脫劑D：體積比為1∶1的甲醇-乙酸乙酯對(duì)目標(biāo)抗生素的洗脫效果，如圖2所示，洗脫劑A對(duì)所有目標(biāo)抗生素的洗脫效果均較好，回收率介于57.02%～156.79%；當(dāng)使用洗脫劑B、C和D時(shí)，四環(huán)素類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率均小于35%。因此，本文選擇體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸-甲醇溶液作為洗脫劑。

圖2 不同洗脫劑下目標(biāo)抗生素回收率Fig.2 Target antibiotic recovery rate under different eluents

4大類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，極性和酸堿性差異較大。根據(jù)目標(biāo)分析物的理化性質(zhì)和前人的研究發(fā)現(xiàn)，由乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑和弱酸弱堿溶液組成的萃取劑可以有效提取固相樣品中殘留的抗生素等藥物[28,32-35]。同時(shí)，亦有研究者發(fā)現(xiàn)在萃取劑中添加Mg2+鹽可以有效提高喹諾酮類抗生素的回收率[19-20]。本文考察了萃取劑A：體積比為3∶1的McIlvaine緩沖液-乙腈和Mg(NO3)2-NH3·H2O、萃取劑B：體積比為1∶1的McIlvaine緩沖液和甲醇溶液和萃取劑C：體積比為1∶1的McIlvaine緩沖液和乙腈溶液對(duì)21種目標(biāo)抗生素的提取效果，如圖3所示，萃取劑A對(duì)所有目標(biāo)抗生素的提取效果均較好，回收率介于43.3%～143.8%；當(dāng)使用萃取劑B和C時(shí)，無(wú)法提取出NOR、OFL和CIP。因此，本文選擇體積比為3∶1的McIlvaine緩沖液-乙腈和Mg(NO3)2-NH3·H2O作為污泥樣品的萃取劑。

圖3 不同萃取劑下目標(biāo)抗生素回收率Fig.3 Target antibiotic recovery rate under different extractants

2.4 線性范圍、檢出限、定量限和回收率

配制1、5、10、50、100、250、500和1 000 μg/L不同質(zhì)量濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.4中的分析條件進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線，線性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。結(jié)果表明，15種目標(biāo)抗生素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.995，滿足測(cè)定要求。儀器的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以信噪比(S/N)≥3和S/N≥10來(lái)確定，獲得15種目標(biāo)抗生素的LOD和LOQ分別為0.01 μg/L～2.97 μg/L和0.06 μg/L～9.90 μg/L。以污水和污泥樣品為基底進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度為100 μg/L，設(shè)置3個(gè)平行樣，按1.3中的方法進(jìn)行樣品前處理，考察方法回收率和精密度。結(jié)果表明，目標(biāo)抗生素在污水和污泥基質(zhì)中的回收率分別為57.02%～156.79%和36.98%～143.76%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.18%～10.64%和0.77%～8.31%。

表2 15種抗生素的線性范圍、線性方程、檢出限、定量限和回收率Table 2 The linear range, linear equation, limit of detection, limit of quantitation and recoveries of 15 target antibiotics

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

將本文所建立的方法應(yīng)用于四川省資陽(yáng)市某市政污水處理廠污水和污泥樣品中抗生素的測(cè)定，結(jié)果如圖4和圖5所示。污水和污泥中各有10種目標(biāo)抗生素被檢出，其濃度分別為9.70 ng/L～551.27 ng/L和15.73 ng/g～2 972.20 ng/g。出水中殘留的抗生素污染物主要為SCP和OFL，其濃度分別為196.05 ng/L和494.67 ng/L；污泥中殘留的抗生素污染物主要為NOR和OFL，其濃度分別為2 113.63 ng/g～2 437 ng/g和2 901.03 ng/g～2 972.20 ng/g。污水處理工藝對(duì)部分抗生素難以有效去除或是沒(méi)有真正的去除。因此，有必要針對(duì)污水處理廠中抗生素類污染物的分布和去除進(jìn)行深入研究。

圖4 資陽(yáng)市某市政污水處理廠不同處理單元水樣中抗生素濃度Fig.4 Concentration of antibiotics in wastewater of different treatment units from a municipal wastewater treatment plant in Ziyang

圖5 資陽(yáng)市某市政污水處理廠不同處理單元污泥中抗生素濃度Fig.5 Concentration of antibiotics in the sludge of different treatment units from a municipal wastewater treatment plant in Ziyang

3 結(jié) 論

本文基于USE/SPE-UPLC-MS/MS技術(shù)，著重優(yōu)化了目標(biāo)抗生素的提取條件、富集凈化過(guò)程中的洗脫條件以及LC-MS條件，建立了一種適用于污水和污泥中四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類共15種典型抗生素的同步測(cè)定方法，方法檢出限和定量限分別為0.01 μg/L～2.97 μg/L和0.06 μg/L～9.90 μg/L，污水和污泥的加標(biāo)回收率分別為57.02%～156.79%和36.98%～143.76%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.18%～10.64%和0.77%～8.31%。本方法成功應(yīng)用于資陽(yáng)市某污水處理廠污水和污泥樣品的檢測(cè)中，共檢出10種抗生素，其在污水和污泥中的濃度分別為9.70 ng/L～551.27 ng/L和15.73 ng/g～2 972.20 ng/g。