何芳，孫琦，李彪，劉政，黃家風(fēng)

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子832003)

大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)引起的棉花黃萎病是當(dāng)前威脅我國棉花生產(chǎn)最主要的病害，每年在發(fā)病嚴(yán)重的地區(qū)造成棉花減產(chǎn)高達(dá)30%以上[1]。大麗輪枝菌沿植物根部維管組織向上侵染，其形成的微菌核在土壤中長期存活[2]，常規(guī)農(nóng)業(yè)防治和藥劑防治難以奏效，因此針對該病害的防治主要集中在選育和利用抗病品種上。目前推廣應(yīng)用的棉花品種抗黃萎病性能不斷提高，但是黃萎病依然發(fā)生嚴(yán)重，究其原因除了陸地缺乏棉抗黃萎病種質(zhì)資源外[3]，病原種群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化也是一個(gè)重要因素[4]。一般認(rèn)為棉花黃萎病菌落葉型致病力比非落葉型致病力強(qiáng)[4-5]，落葉型菌系呈現(xiàn)逐年增加趨勢，已逐步取代非落葉型菌系成為棉田的主要致病類型[4,6]。然而不同的棉花品種響應(yīng)大麗輪枝菌的侵染是否存在差異尚不清楚。

植物與病原互作中，植物為抵御病原物侵染，通過細(xì)胞膜上的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRR)識(shí)別病原物相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)觸發(fā)基礎(chǔ)免疫反應(yīng)[7-8]，如氣孔關(guān)閉、活性氧爆發(fā)、胼胝質(zhì)沉積以及病程相關(guān)(Pathogenesis related，PR)基因的表達(dá)等，以達(dá)到抑制病原物生長,實(shí)現(xiàn)植物對病原物的防御[9-10]。植物的PR基因既能響應(yīng)生物脅迫也能響應(yīng)非生物脅迫[11-12]，其編碼的PR蛋白在植物體外表現(xiàn)出潛在的抗菌活性，在植物體內(nèi)的積累與植物的抗性反應(yīng)密切相關(guān)[11]。根據(jù)來源植物、電泳遷移率、氨基酸序列的同源性和生化功能等特性，PR蛋白基因分為17個(gè)家族[12-13]。PR1是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的多基因家族，表達(dá)PR1基因的轉(zhuǎn)基因煙草和番茄可明顯增強(qiáng)對卵菌和真菌的抵抗能力[14-15]，并且PR1基因已被廣泛用于過敏性反應(yīng)(HR)介導(dǎo)的防御途徑和水楊酸介導(dǎo)的抗性反應(yīng)被激活的指示基因[16]。PR2基因家族編碼β-1,3葡聚糖酶，能催化降解病原真菌細(xì)胞壁中的β-1，3葡聚糖成分[17]。PR3、PR4、PR8、PR11基因家族編碼幾丁質(zhì)酶，能夠降解病原真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)成分[17-20]。PR5基因家族編碼的蛋白包括 permatins、zeamatins、osmotins和類甜蛋白(thaumamatin like proteins，TLP)，具抗真菌活性[21]，分別過表達(dá)煙草和茶樹TLP基因的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯均表現(xiàn)明顯的抗真菌特性[22-23]。PR6基因家族編碼蛋白酶抑制劑(PI)，其靶標(biāo)是昆蟲和微生物的蛋白酶，體內(nèi)過表達(dá)PR6基因的擬南芥和煙草能增強(qiáng)對灰霉菌的抗性[11,24]。PR7基因編碼的蛋白最早從番茄中提純獲得，是由柑橘裂皮類病毒(Citrusexocortisviroid)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種胞內(nèi)蛋白酶[25]。PR9基因家族編碼過氧化物酶是細(xì)胞壁構(gòu)建過程中的關(guān)鍵酶，當(dāng)植物遭受病原物侵染時(shí)，PR9蛋白通過促進(jìn)木質(zhì)素沉積，增加細(xì)胞壁機(jī)械性能以抵御病原物入侵[26]。PR10基因家族編碼的蛋白具有核酸酶活性，如甜椒CaPR10基因受煙草花葉病毒(TMV)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的核酸酶，通過降解病毒核酸使甜椒具有更強(qiáng)的抗病毒能力[27]，此外，PR10蛋白還具有配體結(jié)合特性和翻譯后修飾等功能[21]。PR12基因家族編碼植物防御素，通過抑制真菌生長使植物具有抗真菌特性，如過表達(dá)蘿卜防御素基因的轉(zhuǎn)基因煙草對長柄鏈格孢產(chǎn)生抗性[11,28]。PR13基因家族編碼硫素蛋白，異源表達(dá)擬南芥硫素基因的轉(zhuǎn)基因番茄和異源表達(dá)大麥硫素基因的轉(zhuǎn)基因煙草分別對鐮刀菌和丁香假單胞菌產(chǎn)生抗性，表明硫素蛋白對植物病原真菌和細(xì)菌都具有抗菌活性[29-30]。PR14基因家族編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(LTPs)，功能包括角質(zhì)素合成、生物氧化、植物系統(tǒng)獲得抗性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、以及抗真菌和細(xì)菌活性；異源表達(dá)大麥LTP基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥對丁香假單胞菌和灰霉菌都能產(chǎn)生抗性[11,31]。PR15和PR16基因編碼的蛋白都具有草酸氧化酶活性，在大麥?zhǔn)馨追劬秩緯r(shí)誘導(dǎo)表達(dá)，并通過產(chǎn)生過氧化氫參與植物防御反應(yīng)[32-33]。PR17基因受病原物誘導(dǎo)表達(dá)并能與病原物效應(yīng)子直接互作，如煙草NtPRp27基因和小麥WCI-5基因分別受TMV和小麥白粉病菌誘導(dǎo)表達(dá)并積累[34-35]，大麥HvPR-17c通過與布氏白粉病菌(Blumeriagraminis)的效應(yīng)子互作阻止病原菌侵染[36]。

杜旋等[37]研究發(fā)現(xiàn)大麗輪枝菌 PAMP誘導(dǎo)處理后GhPR基因普遍上調(diào)表達(dá)，但是對于不同抗性陸地棉品種受大麗輪枝菌侵染以及同一個(gè)抗性品種受不同致病型大麗輪枝菌誘導(dǎo)后，14個(gè)GhPR基因表達(dá)是否存在差異，目前尚未明確。本文研究抗、感病棉花品種中GhPR基因響應(yīng)寄主和非寄主來源的落葉型和非落葉型大麗輪枝菌的表達(dá)差異，為進(jìn)一步揭示棉花-大麗輪枝菌互作機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的大麗輪枝菌菌株共有4種，其中棉花黃萎病菌落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6均分離自新疆棉花(棉區(qū)栽培品種)，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；非落葉型菌株V31分離自寧波茄子，由寧波動(dòng)植物出入境檢驗(yàn)檢疫局段維軍惠贈(zèng)；落葉型菌株S1分離自內(nèi)蒙古向日葵，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)景嵐教授惠贈(zèng)。以上供試菌株的致病力和致病型均得到驗(yàn)證[38]。

1.2 供試棉花品種

高感黃萎病品種為新陸早1號(hào)和軍棉1號(hào)，抗黃萎病棉花品種為中植棉2號(hào)。

1.3 無菌棉苗的培育

挑選脫絨后籽粒飽滿的棉花種子，剝?nèi)シN皮，用0.1%升汞消毒20 min，期間多次震蕩混勻，無菌水沖洗5或6遍，放入MS培養(yǎng)基中，28 ℃暗培養(yǎng)，3 d后長出的無菌棉苗扶正，放入盛有無菌水小燒杯，再轉(zhuǎn)入大燒杯中封口，28 ℃光照培養(yǎng)備用。

1.4 大麗輪枝菌對棉苗根部的處理

將PDA平板上培養(yǎng)7 d的菌株用10 mm打孔器取10塊菌餅，放入Czapek-Dox培養(yǎng)基中26 ℃，200 r/min搖培 3 d，4層紗布過濾收集真菌的分生孢子，用無菌水調(diào)整孢子濃度至107cfu/mL。在含200 mL無菌水培養(yǎng)的棉苗中加入1 mL孢子懸浮液，然后分別在接種3、6、12 h剪下棉花根系，無菌水沖洗后液氮速凍保存或直接進(jìn)行RNA提取。以無菌水處理的棉花作為陰性對照。每一處理3次重復(fù)。

1.5 棉花根組織總RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)分析

利用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取棉花根組織總RNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆?，每個(gè)材料取3株樣品；利用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)系統(tǒng)對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后利用PowerUp SYBR Green Master Mix(Life Technologies)試劑盒和7500 Real Time PCR System(Life Technologies)系統(tǒng)對目標(biāo)基因GhPR的轉(zhuǎn)錄表達(dá)通過qPCR進(jìn)行測定。所用引物見表1，以Ghactin基因(DQ266153)作為內(nèi)參基因[37]對目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；將無菌水處理對照棉花的GhPR基因表達(dá)水平設(shè)為1，將標(biāo)準(zhǔn)化的GhPR基因表達(dá)水平與對照GhPR基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，獲得各個(gè)GhPR基因轉(zhuǎn)錄水平的相對表達(dá)量；每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。qPCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；40 cycles。

表1 檢測陸地棉GhPRs基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)所用引物[37]

根據(jù)2-ΔΔCt方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病棉花品種GhPR基因響應(yīng)棉花黃萎病菌的表達(dá)分析

研究感病棉花品種的GhPR基因響應(yīng)不同致病型大麗輪枝菌的表達(dá)差異中，數(shù)據(jù)采用Dunnett法進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)(**P<0.01)，誤差線表示3個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。首先用棉花黃萎病菌的落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6對感病品種軍棉1號(hào)進(jìn)行誘導(dǎo)處理，結(jié)果見圖1。

圖1 V592和I6菌株誘導(dǎo)處理感病品種軍棉1號(hào)后GhPR基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況

圖1顯示：V592菌株誘導(dǎo)9個(gè)GhPR基因上調(diào)表達(dá)，I6菌株誘導(dǎo)11個(gè)GhPR基因上調(diào)表達(dá)，多數(shù)GhPR基因在3 h即出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，并持續(xù)至6 h或12 h。比較2個(gè)菌株誘導(dǎo)的每個(gè)GhPR基因的最高相對表達(dá)量可知：落葉型菌株V592在3 h誘導(dǎo)GhPR5、GhPR10、GhPR11基因和12 h誘導(dǎo)GhPR15、GhPR16和GhPR17基因的相對表達(dá)量達(dá)到最大，分別是陰性對照的42.9倍、5.7倍、10.1倍、100.9倍、269.8倍和103.5倍；而I6菌株在3 h誘導(dǎo)GhPR5基因、12 h誘導(dǎo)GhPR10、GhPR11、GhPR15、GhPR16和GhPR17基因的最大相對表達(dá)量分別是陰性對照的14.8倍、3.6倍、5.3倍、13.1倍、69.4倍和11.8倍，明顯低于V592誘導(dǎo)處理后的表達(dá)量，表明落葉型菌株V592誘導(dǎo)這 6個(gè)基因上調(diào)表達(dá)的程度比非落葉型菌株I6強(qiáng)。然而經(jīng)I6菌株誘導(dǎo)處理，GhPR1、GhPR4、GhPR8、GhPR9和GhPR145個(gè)基因分別在3 h、12 h、12 h、6 h和12 h時(shí)相對表達(dá)量達(dá)到最高，分別是陰性對照的17.2倍、204.3倍、272.4倍、11.1倍和5.1倍，明顯高于經(jīng)V592菌株誘導(dǎo)處理后的表達(dá)量，V592菌株誘導(dǎo)GhPR1、GhPR4和GhPR8基因的最高相對表達(dá)量分別是陰性對照的2.5倍(3 h)、173.6倍(12 h)和99.5倍(12 h)，而GhPR9和GhPR14基因受V592菌株誘導(dǎo)并不表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，表明非落葉型菌株I6誘導(dǎo)GhPR1、GhPR4、GhPR8、GhPR9和GhPR145個(gè)基因上調(diào)表達(dá)的程度比落葉型菌株V592強(qiáng)。上述結(jié)果表明，在棉花感病品種軍棉1號(hào)上，棉花黃萎病菌落葉型菌株和非落葉型菌株均能誘導(dǎo)不同的GhPR基因上調(diào)表達(dá)，但2種致病型黃萎病菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的GhPR基因個(gè)數(shù)及表達(dá)量存在差異。

再用V592菌株和I6菌株對感病品種新陸早1號(hào)進(jìn)行誘導(dǎo)處理，結(jié)果見圖2。

圖2 V592和I6菌株誘導(dǎo)處理感病品種新陸早1號(hào)后GhPR基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況

圖2顯示：落葉型菌株V592誘導(dǎo)7個(gè)GhPR基因上調(diào)表達(dá)，非落葉型菌株I6誘導(dǎo)10個(gè)GhPR基因上調(diào)表達(dá)。對2個(gè)菌株誘導(dǎo)的每個(gè)GhPR基因的最高相對表達(dá)量進(jìn)行比較可知：落葉型菌株V592在12 h誘導(dǎo)GhPR5和GhPR10基因、6 h誘導(dǎo)GhPR11基因的最大相對表達(dá)量分別是陰性對照的55.3倍、37.4倍和89.1倍；而I6菌株在12 h誘導(dǎo)GhPR5和GhPR10基因、6 h誘導(dǎo)GhPR11基因的最高相對表達(dá)量分別是對照的4.5倍、2.1倍和2.6倍，明顯低于V592誘導(dǎo)處理后的表達(dá)量，表明在感病品種新陸早1號(hào)上，落葉型菌株V592誘導(dǎo)這3個(gè)基因上調(diào)表達(dá)的程度比非落葉型菌株I6強(qiáng)。然而經(jīng)I6菌株誘導(dǎo)處理，GhPR8、GhPR15和GhPR17基因分別在12、6、12 h時(shí)相對表達(dá)量達(dá)到最高，分別是對照的20.1倍、7.6倍和15.2倍，明顯高于V592菌株對這3個(gè)基因的誘導(dǎo)表達(dá)，V592菌株均在12 h誘導(dǎo)GhPR8、GhPR15和GhPR17基因達(dá)到最大相對表達(dá)量，分別是對照的4.5倍、5.3倍和2.5倍。I6在12 h誘導(dǎo)GhPR1基因、3 h誘導(dǎo)GhPR14基因、12 h誘導(dǎo)GhPR16基因的最大相對表達(dá)量分別是對照的4.3倍、8.4倍和69.4倍，而這3個(gè)基因均不受V592菌株誘導(dǎo)表達(dá)。因此在感病品種新陸早1號(hào)上，非落葉型菌株I6誘導(dǎo)GhPR1、GhPR8、GhPR14、GhPR15、GhPR16和GhPR176個(gè)基因上調(diào)表達(dá)的程度比落葉型菌株V592強(qiáng)。

上述結(jié)果表明：在棉花感病品種新陸早1號(hào)上，棉花黃萎病菌落葉型菌株V592誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的GhPR基因總數(shù)及相對表達(dá)量達(dá)到最大的GhPR基因數(shù)都沒有I6菌株誘導(dǎo)的GhPR基因多。

2.2 抗病棉花品種GhPR基因響應(yīng)棉花黃萎病菌的表達(dá)分析

為了研究抗病棉花品種的GhPR基因響應(yīng)不同致病型大麗輪枝菌的表達(dá)差異，用落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6對抗病品種中植棉2號(hào)進(jìn)行誘導(dǎo)處理，結(jié)果見圖3。

圖3 V592和I6菌株誘導(dǎo)處理抗病品種中植棉2號(hào)后GhPR基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況

圖3顯示:V592菌株誘導(dǎo)9個(gè)GhPR基因上調(diào)表達(dá)，不誘導(dǎo)GhPR7、GhPR9和GhPR11基因表達(dá)；I6菌株誘導(dǎo)11個(gè)GhPR基因上調(diào)表達(dá)，不誘導(dǎo)GhPR9基因表達(dá)。對2個(gè)菌株誘導(dǎo)的每個(gè)GhPR基因的最高相對表達(dá)量進(jìn)行比較可知：雖然I6菌株可誘導(dǎo)11個(gè)GhPR基因上調(diào)表達(dá)，但每個(gè)基因上調(diào)表達(dá)的幅度不大，其中GhPR16基因上調(diào)幅度最高，12 h時(shí)其最高相對表達(dá)量是對照的22.6倍，GhPR5基因上調(diào)幅度最低，12 h時(shí)其最高相對表達(dá)量是對照的2.5倍。然而V592菌株誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的9個(gè)基因，其中8個(gè)基因均在誘導(dǎo)6 h時(shí)相對表達(dá)量達(dá)到最高，與陰性對照相比，每個(gè)GhPR基因的上調(diào)表達(dá)幅度顯著增高，如GhPR5和GhPR16基因的最高相對表達(dá)量分別是對照的1928.5倍和1407.3倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于I6菌株誘導(dǎo)GhPR5和GhPR16基因最高相對表達(dá)量分別是對照的2.5倍和22.6倍；V592菌株誘導(dǎo)GhPR8、GhPR14和GhPR15基因的最高相對表達(dá)量分別是對照的359.4倍、489.8倍和394.7倍；GhPR4、GhPR10和GhPR17基因的最高相對表達(dá)量分別是對照的178.1倍、192.6倍和118.7倍；GhPR1基因上調(diào)表達(dá)的幅度最小，3 h時(shí)其最高相對表達(dá)量也是對照的75.9倍。

綜上可知：在棉花抗病品種中植棉2號(hào)上，落葉型菌株V592誘導(dǎo)9個(gè)GhPR基因上調(diào)表達(dá)的程度明顯比非落葉型菌株I6強(qiáng)，且GhPR基因上調(diào)表達(dá)的幅度顯著增強(qiáng)。

2.3 感病棉花品種GhPR基因響應(yīng)非寄主來源大麗輪枝菌的表達(dá)分析

為了明確感病棉花品種的GhPR基因響應(yīng)非寄主作物來源大麗輪枝菌的表達(dá)差異，分別用分離自向日葵的落葉型菌株S1和茄子上的非落葉型菌株V31誘導(dǎo)處理感病棉花品種軍棉1號(hào)，結(jié)果見圖4。

圖4 其他寄主來源的大麗輪枝菌誘導(dǎo)處理感病品種軍棉1號(hào)后GhPR基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況

圖4顯示：S1和V31菌株均誘導(dǎo)10個(gè)GhPR基因上調(diào)表達(dá)。比較2個(gè)菌株誘導(dǎo)的每個(gè)GhPR基因的最高相對表達(dá)量可知：落葉型菌株S1在6 h誘導(dǎo)GhPR11和GhPR15基因、12 h誘導(dǎo)GhPR14和GhPR17基因上調(diào)表達(dá)幅度最大，其最高相對表達(dá)量分別是對照的198.6倍、17.4倍、18.9倍和20.5倍；而V31誘導(dǎo)這4個(gè)基因的最大相對表達(dá)量分別是對照的2.2倍、3.7倍、2.7倍和6.7倍，因此S1誘導(dǎo)GhPR11、GhPR15、GhPR14和GhPR174個(gè)基因達(dá)到的最高相對表達(dá)量明顯高于V31誘導(dǎo)的表達(dá)量。非落葉型菌株V31在3h誘導(dǎo)GhPR9基因、6h誘導(dǎo)GhPR4、GhPR5、GhPR8、GhPR10和GhPR16基因上調(diào)表達(dá)的最大相對表達(dá)量分別是對照的19.3倍、28.5倍、46.2倍、23.2倍、15.0倍和28.7倍，明顯高于S1誘導(dǎo)這6個(gè)基因在不同時(shí)段的最高相對表達(dá)量，S1誘導(dǎo)GhPR9、GhPR4、GhPR5、GhPR8、GhPR10和GhPR166個(gè)基因的最大相對表達(dá)量分別是對照的1.8倍、3.2倍、12.0倍、2.4倍、6.0倍和14.8倍。

再用非寄主作物作物來源的2個(gè)菌株誘導(dǎo)處理感病品種新陸早1號(hào)，結(jié)果(圖5)顯示：S1菌株誘導(dǎo)11個(gè)GhPR基因上調(diào)表達(dá)，不誘導(dǎo)GhPR5基因上調(diào)表達(dá)；V31菌株誘導(dǎo)12個(gè)GhPR基因上調(diào)表達(dá)。比較各菌株誘導(dǎo)的每個(gè)GhPR基因的最高相對表達(dá)量可知：S1菌株誘導(dǎo)5個(gè)GhPR基因的上調(diào)表達(dá)量明顯高于V31菌株，即S1菌株在12h誘導(dǎo)GhPR4基因、6h誘導(dǎo)GhPR1、GhPR9、GhPR10和GhPR15基因上調(diào)表達(dá)幅度最大，其最高相對表達(dá)量分別是對照的20.7倍、38.0倍、38.0倍、38.0倍和19.6倍；而V31誘導(dǎo)這5個(gè)基因達(dá)到的最高相對表達(dá)量分別是對照的17.4倍、6.2倍、31.8倍、3.4倍和11.1倍。V31菌株誘導(dǎo)7個(gè)GhPR基因的上調(diào)表達(dá)量明顯高于S1菌株，即V31菌株在6h誘導(dǎo)GhPR5、GhPR7和GhPR14基因、12h誘導(dǎo)GhPR8、GhPR11和GhPR16基因、3h誘導(dǎo)GhPR17基因上調(diào)表達(dá)幅度最大，其最高相對表達(dá)量分別是對照的4.5倍、7.4倍、15.0倍、137.6倍、14.4倍、152.2倍和9.1倍；而S1誘導(dǎo)這7個(gè)基因達(dá)到的最高相對表達(dá)量分別是對照的1.6倍、4.1倍、3.5倍、10.2倍、9.9倍、54.8倍和7.7倍。

圖5 其他寄主來源的大麗輪枝菌誘導(dǎo)處理感病品種新陸早1號(hào)后GhPR基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況

上述結(jié)果表明：大麗輪枝菌非寄主作物來源的落葉型菌株S1和非落葉型菌株V31均可誘導(dǎo)感病品種軍棉1號(hào)和新陸早1號(hào)不同的GhPR基因上調(diào)表達(dá)，非落葉型菌株V31誘導(dǎo)GhPR基因達(dá)到最大相對表達(dá)量的基因個(gè)數(shù)比落葉型菌株S1誘導(dǎo)的多。

2.4 抗病棉花品種GhPR基因響應(yīng)非寄主來源大麗輪枝菌的表達(dá)分析

用非寄主作物來源的2個(gè)菌株誘導(dǎo)處理棉花抗病品種中植棉2號(hào)，結(jié)果(圖6)顯示：S1菌株和V31菌株均誘導(dǎo)12個(gè)GhPR基因上調(diào)表達(dá)。對2個(gè)菌株誘導(dǎo)的每個(gè)GhPR基因的最高相對表達(dá)量進(jìn)行比較可知：S1菌株誘導(dǎo)9個(gè)GhPR基因的上調(diào)表達(dá)量明顯高于V31菌株，即S1菌株在3 h誘導(dǎo)GhPR4、GhPR14、GhPR15和GhPR174個(gè)基因上調(diào)表達(dá)的最高相對表達(dá)量分別是對照的186.0倍、36.9倍、31.5倍和14.4倍；12 h誘導(dǎo)GhPR1、GhPR8、GhPR9、GhPR10和GhPR115個(gè)基因上調(diào)表達(dá)的最高相對表達(dá)量分別是對照的40.6倍、7.6倍、8.5倍、22.2倍和174.8倍；V31誘導(dǎo)這9個(gè)基因達(dá)到的最高相對表達(dá)量分別是對照的8.5倍、21.2倍、3.1倍、1.9倍、13.1倍、3.7倍、1.5倍、5.4倍和14.4倍。而V31菌株僅誘導(dǎo)2個(gè)GhPR基因的最大相對表達(dá)量明顯高于S1菌株，即V31菌株在3 h誘導(dǎo)GhPR5和GhPR16基因上調(diào)表達(dá)的最高相對表達(dá)量分別是對照的6.7倍和32倍；S1誘導(dǎo)這2個(gè)基因達(dá)到的最高相對表達(dá)量分別是對照的5.8倍、6.2倍。

圖6 其他寄主來源的大麗輪枝菌誘導(dǎo)處理抗病品種中植棉2號(hào)后GhPR基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況

上述結(jié)果表明，大麗輪枝菌非寄主作物來源的落葉型菌株S1和非落葉型菌株V31均可誘導(dǎo)抗病品種中植棉2號(hào)不同的GhPR基因上調(diào)表達(dá)，落葉型菌株S1誘導(dǎo)GhPR基因達(dá)到最大相對表達(dá)量的基因個(gè)數(shù)明顯多于V31菌株。

3 結(jié)論與討論

(1)在2個(gè)感病棉花品種上，寄主來源的落葉型和非落葉型黃萎病菌均能誘導(dǎo)GhPR基因普遍上調(diào)表達(dá)，而在感病品種軍棉1號(hào)上，2個(gè)菌株誘導(dǎo)GhPR基因上調(diào)表達(dá)的能力相當(dāng)；在感病品種新陸早1號(hào)上，非落葉型菌株I6誘導(dǎo)GhPR基因上調(diào)表達(dá)的能力比落葉型菌株V592強(qiáng)，表明棉花感病品種的GhPR基因?qū)β淙~型和非落葉型黃萎病菌侵染均有一定的響應(yīng)能力。然而感病品種對2種致病類型黃萎病菌的侵染卻表現(xiàn)明顯不同的抗性反應(yīng)：對于非落葉型菌株的侵染表現(xiàn)一定的抗病性，如2000年以前，新疆棉區(qū)黃萎病菌以非落葉型菌系為主[39]，沒有落葉型黃萎病菌的發(fā)生，雖然當(dāng)時(shí)種植的棉花品種多為感病品種，但棉花黃萎病發(fā)生并不嚴(yán)重，推測可能與非落葉型菌系能夠誘導(dǎo)感病品種不同的GhPR基因上調(diào)表達(dá)，誘導(dǎo)了植物免疫有關(guān)；盡管感病品種的GhPR基因?qū)β淙~型黃萎病菌也有一定的響應(yīng)能力，但是感病品種對于落葉型菌株的侵染卻表現(xiàn)高度敏感[38]，其原因是否與落葉型黃萎病菌比非落葉型黃萎病菌產(chǎn)生更多或更強(qiáng)的效應(yīng)子蛋白，能夠克服感病品種的免疫應(yīng)答有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

(2)在棉花抗病品種中植棉2號(hào)上，落葉型菌株V592誘導(dǎo)GhPR基因上調(diào)表達(dá)的強(qiáng)度明顯比非落葉型菌株I6強(qiáng)，如V592誘導(dǎo)中植棉2號(hào)GhPR5和GhPR16基因的最高相對表達(dá)量分別是對照的1928.5倍和1407.3倍，表明棉花抗病品種的GhPR基因?qū)γ藁S萎病菌落葉型菌系具有更強(qiáng)的響應(yīng)能力。然而盡管目前推廣應(yīng)用的棉花品種抗病性不斷增強(qiáng)，但是近年棉花主產(chǎn)區(qū)黃萎病卻逐年加重，落葉型黃萎病菌已逐步取代非落葉型菌系成為棉田只要的致病類型[6]，說明隨著品種抗性的不斷增強(qiáng)，病原菌致病性與之協(xié)同進(jìn)化也在不斷增強(qiáng)。有研究表明，大麥的HvPR17c(PR17蛋白)可以與布氏白粉病菌(Blumeriagraminis)的效應(yīng)子直接互作阻止病原菌侵染[36]；也有研究表明，棉花黃萎病菌產(chǎn)生的效應(yīng)子PevD1可以抑制GhPR5蛋白的抗真菌活性從而克服寄主的防御反應(yīng)[40]。雖然目前在棉花-黃萎病菌中沒有發(fā)現(xiàn)類似于番茄大麗輪枝菌1號(hào)生理小種AVe1基因誘導(dǎo)含Ve1基因的番茄產(chǎn)生抗病性的互作關(guān)系[41]，但是棉花抗病品種的GhPR基因響應(yīng)落葉型黃萎病菌表現(xiàn)強(qiáng)烈表達(dá)可能與落葉型黃萎病菌產(chǎn)生了更多有效的效應(yīng)子激活了寄主的抗性反應(yīng)有關(guān)，也可能與抗病品種中含有更可以多識(shí)別效應(yīng)子的抗病蛋白有關(guān)，但是GhPR蛋白-效應(yīng)子-抗病蛋白之間存在怎樣的互作關(guān)系有待深入研究。

用非寄主作物的2個(gè)大麗輪枝菌菌株分別處理2個(gè)感病棉花品種和1個(gè)抗病棉花品種，結(jié)果表明：非落葉型菌株V31誘導(dǎo)感病品種GhPR基因上調(diào)表達(dá)的能力比落葉型菌株S1強(qiáng)；落葉型菌株S1誘導(dǎo)抗病品種GhPR基因上調(diào)表達(dá)的能力明顯比V31菌株強(qiáng)。這與寄主來源的V592和I6菌株分別在抗病和感病品種上的誘導(dǎo)結(jié)果基本一致。從基因上調(diào)表達(dá)的幅度來看，在抗病品種上，非落葉型菌株I6和V31誘導(dǎo)GhPR基因表達(dá)的上調(diào)幅度都比較小；但是對于落葉型菌株，非寄主來源的S1菌株誘導(dǎo)GhPR基因上調(diào)表達(dá)幅度明顯低于寄主來源的V592。表明抗病品種GhPR基因響應(yīng)寄主來源落葉型菌株的能力比響應(yīng)非寄主來源落葉型菌株的能力強(qiáng)。

(3)杜旋等根據(jù)大麗輪枝菌壞死和乙烯誘導(dǎo)蛋白(necrosis and ethylene-inducing peptide 1-like protein，NLP)設(shè)計(jì)了3個(gè)多肽片段nlp20Vd2、nlp20Vd2和 nlp20Vd2作為PAMP分子誘導(dǎo)處理棉花感病品種新陸早6號(hào)，結(jié)果顯示，3個(gè)多肽片段都能誘導(dǎo)GhPR基因上調(diào)表達(dá)，除了nlp20Vd2誘導(dǎo)的2個(gè)GhPR基因上調(diào)幅度與對照相比分別達(dá)到13和16倍外，其他GhPRs基因的上調(diào)幅度與對照相比都在2～6倍之間[37]。而本研究直接用大麗輪枝菌處理棉花根系，非落葉型菌株誘導(dǎo)感病品種GhPR基因的上調(diào)幅度和落葉型菌株誘導(dǎo)抗病品種GhPR基因的上調(diào)幅度均普遍高于單個(gè)肽段誘導(dǎo)GhPR基因的上調(diào)幅度，尤其是落葉型菌株誘導(dǎo)抗病品種GhPR基因的上調(diào)幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過單個(gè)肽段誘導(dǎo)GhPR基因的上調(diào)幅度，這可能與大麗輪枝菌具更多的PAMP分子有關(guān)，因?yàn)槌薔LP蛋白具有PAMP活性，植物病原真菌的幾丁質(zhì)寡糖、木聚糖酶、多聚半乳糖醛羧酶(PGs)都可作為PAMP分子觸發(fā)PTI[42]，激活包括PR基因表達(dá)在內(nèi)的植物免疫反應(yīng)。

(4)比較3個(gè)棉花品種響應(yīng)棉花黃萎病菌侵染，GhPR5、GhPR8、GhPR10、GhPR15、GhPR17這5個(gè)基因均表現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)，且大多數(shù)在誘導(dǎo)處理 6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，說明這5個(gè)基因可作為棉花響應(yīng)棉花黃萎病菌免疫反應(yīng)的指示基因，誘導(dǎo)處理6 h時(shí)為最佳測定時(shí)間；GhPR4、GhPR5、GhPR8、GhPR10、GhPR14、GhPR15、GhPR16和GhPR17均在誘導(dǎo)處理6 h時(shí)表達(dá)量最高，可作為抗病品種響應(yīng)落葉型黃萎病菌免疫反應(yīng)的指示基因。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)品種的GhPR2和GhPR3基因響應(yīng)大麗輪枝菌侵染均不表現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)，有的甚至是下調(diào)表達(dá)，其原因有待進(jìn)一步研究。