董巧燕，桑春麗，王寶菊，顏彬，王遠志，吾熱力哈孜·哈孜汗*

(1 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003;2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832003;3 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，湖北 武漢 430022;4 山東棗莊醫(yī)院，山東 棗莊 277100)

喜馬拉雅旱獺(Marmota Himalayana)屬嚙齒目(Rodentia)松鼠科(Sciuridae)旱獺屬(Marmota)的大型的地棲型嚙齒動物，其典型形態(tài)特點為自鼻端經(jīng)兩眼眉間到兩耳前方之間有一個近似于三角形的黑色毛區(qū)，稱為“黑三角”。喜馬拉雅早獺是陸生和穴居的草食性、冬眠性野生動物。主要棲息于海拔2500-5200 m的高山草甸草原、高山草原山地環(huán)境。廣泛分布于我國青藏高原地帶以及印度、尼泊爾、錫金、克什米爾等地，為青藏高原最常見也是體形最大的嚙齒動物。作為生態(tài)系統(tǒng)中的重要一員，喜馬拉雅旱獺對人類及環(huán)境的生存和發(fā)展產(chǎn)生巨大的影響。近年來應(yīng)用該動物建立人類疾病動物模型的研究不斷深入[1]，開展野生旱獺的實驗動物化研究意義重大。

無形體科包括4個屬，分別是無形體屬(Anaplasma)、埃及小體屬(Aegyptianella)、血巴通氏體屬(Heamobartonella)和附紅細(xì)胞體屬(Eperythrozoon)。嗜吞噬細(xì)胞無形體(Anaplasma phagocytophilum)屬于立克次體目(Rickettsiales)、無形體科(Anaplasmataceae)、無形體屬(Anaplasma)，是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，主要寄生在粒細(xì)胞中，引起反芻動物蜱咬熱、馬邊蟲病以及人粒細(xì)胞無形體病。該病原體在歐洲、亞洲及美國分部廣泛，能夠感染多種哺乳動物的粒細(xì)胞，而且不同來源的病原體遺傳變異較大，其生物學(xué)特性也具有很高的多樣性[2]。

埃立克體屬隸屬于立克次體目。自1935年從犬體內(nèi)獲得第1株埃立克體以來，迄今發(fā)現(xiàn)11種埃立克體。目前對埃立克體的分類主要采用細(xì)菌分類鑒別的“金指標(biāo)”，即16 S rRNA基因序列分析法。根據(jù)其同源性，可將埃立克體分為3個基因群，分別為犬埃立克體群、嗜吞噬細(xì)胞埃立克體群和腺熱埃立克體群[3]。

喜馬拉雅旱獺為冬眠動物，因此季節(jié)對其生理生化指標(biāo)有一定的影響，但目前系統(tǒng)對旱獺生物學(xué)特性研究的報道較少，本團隊與華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院聯(lián)合建立了乙肝動物模型-喜馬拉雅野生旱獺的馴化基地，并養(yǎng)殖喜馬拉雅旱獺近兩年，通過定期觀察體重、飲食、活動，對其生理習(xí)性進行記錄，定期采集血樣檢測血常規(guī)、血生化指標(biāo)，建立了一整套喜馬拉雅旱獺病原(包括體內(nèi)細(xì)菌、寄生蟲、病毒、蜱傳病原、蚤傳病原)分子檢測系統(tǒng)，本研究針對蜱傳病原埃立克體和無形體對旱獺進行分子檢測研究，目的是通過對策勒縣捕獲的旱獺進行無形體和埃立克體分子檢測，為喜馬拉雅旱獺作為乙肝實驗動物模型的病原凈化奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在辦理《新疆維吾爾自治區(qū)狩獵證》的基礎(chǔ)上，在2018年8-9月份在新疆和田地區(qū)的策勒縣海拔為2500-5200 m的山區(qū)捕獲喜馬拉雅旱獺52只，采集旱獺血液、肝、脾、心、肺、腎、小腸、大腸等樣本，并登記標(biāo)本的背景資料(包括：時間、地點、性別、年齡及體重等)，快速置于-80 ℃超低溫冰箱保存。DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit(DP060530)購自天根生化科技有限公司；PCR所用試劑均購自大連寶生物工程有限公司；DNA Marker購自北京天根生化科技有限公司；瓊脂糖購自Sigma公司。

1.2 旱獺的鑒定

首先對旱獺的體型、外貌進行形態(tài)學(xué)鑒定，然后根據(jù)已知旱獺線粒體Cytb基因序列在NCBI網(wǎng)站中進行查找，分析驗證參考文獻[4-5]中的引物，委托上海祥音生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成基因引物，引物序列上游為′ATGACAAACACCCGCAAAAYCCA'，下游為′CTTCATTTAAGRAGTTTGTTT'。PCR反應(yīng)體系10×PCR buffer 2.5 μL，三磷酸脫氧核糖核苷 dNTP(10 mmol)2.5 μL，上游引物(20 μmol·L-1)1.5 μL，下游引物(20 μM)1.5 μL，模板DNA(約50 ng·μL-1)2 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，ddH2O 14 μL，總體積25 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，5min；變性95 ℃，60 s,退火48 ℃，60 s,延伸72 ℃，2min，反應(yīng)35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，120伏電泳30 min，放置在凝膠成像儀中拍照分析。然后使用天根生物公司的TIANgel Midi Purification Kit(目錄號：DP209-03)，參照試劑盒說明書操作步驟回收DNA。將目的DNA片段連接在pGM-T載體上，具體操作步驟參照天根生物公司pGM-T克隆試劑盒(目錄號：VT202-02)說明書[6]。將PCR擴增陽性的產(chǎn)物送往北京華大基因公司測序。測序結(jié)果在BLAST工具進行檢索，比對GenBank中已上傳的核酸序列的相似性，并上傳相關(guān)基因序列到NCBI網(wǎng)站。

1.3 旱獺的病原檢測

對進行分子生物學(xué)鑒定的旱獺內(nèi)臟組織樣本置于無菌的EP管中。使用天根生化科技有限公司的TIANamp Genomic DNA Kit(目錄號：DP060530)，參照試劑盒說明書操作步驟提取旱獺組織基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎贸彩絇CR擴增無形體16S rDNA[7]和嗜吞噬細(xì)胞無形體基因MSP4[8]，埃立克體使用引物16S rDNA[7]，引物委托上海祥音生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成基因引物。16S rDNA外圍引物序列上游為′TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG'，下游為′CAC CTCTACACTAGGAATTCCGCTATC'，內(nèi)圍引物序列上游為′GTAATACTGTATAATCCCTG'，下游為′GTA CCGTCATTATCTTCCCTA'。內(nèi)外圍反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性92 ℃，30 s,退火55 ℃，30 s,延伸72 ℃,30 s,反應(yīng)35個循環(huán)；延伸72 ℃，8min。MSP4外圍引物序列上游為′ATGACTTACAGAGAATTGCTTGTAGG'，下游為′TTAATTGAAAGCAAATCTTGCTCCTA'。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s，退火63 ℃，30 s，延伸72 ℃，70 s，反應(yīng)37個循環(huán)；72 ℃延伸6 min。MSP4內(nèi)圍引物序列上游為′CCTATCTGCGGCCGCAGTAT'，下游為′TTGAAGCCGTAACTAGCTATATTTGC'。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s；退火60 ℃，30 s，延伸72 ℃，70 s，反應(yīng)37個循環(huán)；72 ℃延伸6 min。對PCR目的產(chǎn)物進行測序分析，并上傳相關(guān)基因序列到NCBI網(wǎng)站。

1.4 遺傳進化分析

對測序獲得的旱獺序列、無形體和埃立克體序列均進行遺傳進化分析。用自展檢驗(bootstrap test)方法估計系統(tǒng)樹中各個節(jié)點的置信值，繪圖重復(fù)參數(shù)設(shè)置為1 000次，用Maga7.0軟件基于最大相似法(Maximum Likelihood)建立遺傳發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果

2.1 旱獺線粒體基因PCR擴增與Cytb測序鑒定(圖1)

M：MarkerⅢ；1：陰性對照；2：陽性對照；3-6：旱獺組織核酸。

基于Cytb引物PCR擴增喜馬拉雅旱獺線粒體基因片段，在目的片段出現(xiàn)1140 bp大小條帶(圖1)，符合預(yù)期片段長度。經(jīng)比對分析結(jié)果顯示，本研究獲得的旱獺序列與青藏高原東北部的喜馬拉雅旱獺(登錄號：MF115786)同源性最高，與GenBank中已有的獺種相應(yīng)序列的相似性分別達到98.07%～99.35%。

2.2 無形體和埃立克體的檢測

2.2.1 無形體和埃立克體的PCR檢測結(jié)果

基于16S rDNA基因巢式PCR擴增無形體和埃立克體，基于MSP4基因巢式PCR擴增嗜吞噬細(xì)胞無形體，分別得到653 bp(圖2)和849 bp(圖3)，符合預(yù)期片段大小。52份喜馬拉雅旱獺中，PCR檢出4只旱獺組織器官無形體陽性，1只則為埃立克體陽性，個體陽性率分別為7.69%(4/52)和1.92%(1/52)。此外，不同組織的檢測情況有所不同，無形體中以心臟檢出率最高，為7.69%(4/52)；肝臟的檢出率次之，為3.85%(2/52)，在脾臟、肺臟，腎臟和小腸中PCR均檢出1份，陽性率為1.92%(1/52)。埃立克體中分別從肝臟，肺臟和小腸中檢出，陽性率為1.92%(1/52)(表1)。

M：MarkerⅡ；5：陰性對照；6：陽性對照；1：heart(Anaplasma)；2：spleen(Anaplasma)；3：liver(Ehrlichia)；4：lung(Ehrlichia)。

M：MarkerⅢ；4：陰性對照；5：陽性對照；1-3：旱獺心臟組織核酸。

表1 無形體和埃立克體在喜馬拉雅旱獺內(nèi)臟組織中檢測結(jié)果

2.2.2 無形體的測序與遺傳進化分析結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)，捕獲于新疆和田地區(qū)策勒縣高海拔山區(qū)的野生喜馬拉雅旱獺，在其內(nèi)臟組織中檢出無形體的基因型為嗜吞噬細(xì)胞無形體(A.phagocytophilum)，BLAST分析其與馬鹿(Cervus elaphus)、棕熊(bear)、野豬(wild boar)和人等來源的病原對應(yīng)序列(登錄號分別為：MF974855、KM205430、KF747337、KF747336和KF747339)，其同源性為100%。

16S rDNA的遺傳進化樹分析顯示：喜馬拉雅旱獺來源的嗜吞噬細(xì)胞無形體序列與這些物種來源的序列聚為一支，與野馬(Equus caballus)和狗(dog)(登錄號為：EU839859和KP861634)形成姊妹支(圖4)。

圖4 基于無形體16SrDNA基因構(gòu)建的遺傳進化樹

2.2.3 埃立克體的測序與遺傳進化分析結(jié)果

BLAST和16S rDNA 遺傳進化樹分析顯示：本研究獲得的埃立克體序列與亞洲璃眼蜱來源的Ehrlichia sp.(KJ410254)序列具有100%的同源性，在遺傳進化樹中聚為一支，與中國Uncultured Ehrlichia sp.(JX402603)形成姊妹支(圖5)。

圖5 基于埃立克體16SrDNA基因構(gòu)建的遺傳進化樹

3 討論

喜馬拉雅旱獺又名哈拉、雪豬，目前對于喜馬拉雅旱獺的研究僅集中在個別物種以及個別病原(如鼠疫耶爾森菌、布魯氏菌、喜馬拉雅旱獺肝病毒等)的檢測上[9-11]，并沒有引起人們足夠的認(rèn)識。嗜吞噬細(xì)胞無形體是一種專性的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，是一種人畜共患病蜱傳立克次病原體，主要以哺乳動物的粒細(xì)胞為目標(biāo)，定位于細(xì)胞質(zhì)中膜結(jié)合的空泡中，導(dǎo)致人、馬、狗等宿主粒細(xì)胞無形體病，以發(fā)熱伴白細(xì)胞、血小板減少和多器官功能損害為主要臨床表現(xiàn)，該病在北美洲、歐洲和亞洲廣泛傳播[12]。在歐洲，曾在狍、馬鹿、野豬和河堤田鼠(Myodes glareolus)中發(fā)現(xiàn)噬吞噬細(xì)胞無形體的感染[13-14]。RAR等[15]在俄羅斯鄂木斯克省棕背鼠平(Myodes rufocanus)和河堤田鼠中檢測到嗜吞噬細(xì)胞無形體核酸。BATTISTI等[16]在意大利特倫托省的紅貍(Vulpes vulpes)、歐洲獾(Meles meles)和郊狼(Canis lupus)中檢測到嗜吞噬細(xì)胞無形體核酸。在中國，ZHAN等[17]在綿羊、山羊和褐家鼠中也檢測到嗜吞噬細(xì)胞無形體核酸。本研究首次在喜馬拉雅旱獺臟器和組織中檢測到嗜吞噬細(xì)胞無形體核酸，關(guān)于其病原分離、對旱獺的致病性還有待進一步研究。

埃立克體是一種專性細(xì)胞內(nèi)革蘭氏陰性細(xì)菌，可引起人、嚙齒動物、反芻動物和狗致病[18]，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、白細(xì)胞和血小板減少、血清氨基轉(zhuǎn)移酶活性升高，伴有輕度到中度的肝損傷。2010年，NICHOLSON等[19]在美國賓夕法尼亞州的研究證明北美旱獺(Marmota monax)中有查菲埃立克體(Ehrlichia chaffeensis)。2003年，CHAE等[20]在韓國軍事訓(xùn)練基地的黑線姬鼠(Apodemus agrarius)、西伯利亞鼠(Mustela sibirica)和托奈斯特鼠(Cricetulus triton nestor)的脾臟中檢測到犬埃立克體(Ehrlichia canis)、伊氏埃立克體(Ehrlichia ewingii)嗜吞噬細(xì)胞無形體(Anaplasma phagocytophilum)和扁平無形體(Anaplasma platys)核酸，并表明黑線姬鼠是多種無形體和埃立克體主要的感染宿主。在本研究中，我們從喜馬拉雅旱獺肝、肺、小腸中檢出未定名種埃立克體(Ehrlichia sp.)核酸，BLAST分析顯示，該埃立克體與亞洲璃眼蜱的Ehrlichia sp.(KJ410254)序列的同源性為100%?？紤]到埃立克體為蜱傳病原，未來應(yīng)加強喜馬拉雅旱獺體表寄生蜱埃立克次體等蜱傳病原的篩查。

蜱傳病原包括細(xì)菌、寄生蟲和病毒等。喜馬拉雅旱獺是蜱傳病原感染的自然宿主，同時也是乙肝病毒感染的模式實驗動物。未來針對喜馬拉雅旱獺進行蜱傳病原的全面解析，對于喜馬拉雅旱獺蟲媒傳染病的系統(tǒng)認(rèn)識、模式實驗動物的優(yōu)化具有重要意義。