邵焱焱，楊恒，牟健，朱夢婷,3，南穎，任玉軍，趙宗勝*

(1 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；2 西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；3 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室/新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆 石河子 832000)

黃體(Corpora lutea,CL)在哺乳動物中屬于暫時性內(nèi)分泌腺，是建立和維持妊娠的必需內(nèi)分泌器官[1]。正常繁殖周期內(nèi)，如果卵子受精，CL將分泌孕酮等來參與調(diào)節(jié)受精卵著床和妊娠的早期維持。如果卵子未受精或妊娠末期(或分娩后)，CL將會正常溶解成為啟動下一個生殖周期的前提。因此，CL的溶解在哺乳動物的生殖周期中起著重要的“關(guān)卡”作用[2]，對于重啟母畜的生殖周期至關(guān)重要。

目前，關(guān)于黃體溶解涉及的一個經(jīng)典學(xué)說就是前列腺素F2α(ProstaglandinF2α,PGF2α)誘發(fā)黃體退化。有研究表明[3]，綿羊黃體正常溶解開始在生殖周期第14、第15天或第17天才完全溶解，而添加PGF2α可以2天內(nèi)快速使黃體溶解，其類似物廣泛用于同期發(fā)情技術(shù)[4]。與PGF2α相比，前列腺素D2(Prostaglandins D2,PGD2)在繁殖方面具有相關(guān)調(diào)控作用卻未引起人們足夠的重視。

近年來，有研究[5]發(fā)現(xiàn)PGD2能夠增加卵巢顆粒細胞的活力，并通過其關(guān)鍵合成酶HPGDS影響PGD2的合成靶向卵巢組織。同時，SCHRAMM[6](1984)研究顯示，將不同的PGs注入子宮腔時，發(fā)現(xiàn)PGD2是促進子宮內(nèi)膜和子宮肌血流量增加最有效的PGs，并且在黃體期后期PGD2呈現(xiàn)上升趨勢，這提示在黃體退化過程中，PGD2很可能會通過調(diào)節(jié)血管舒張、增加子宮流入卵巢黃體組織的血流量，以促使PGs向卵巢-黃體組織的轉(zhuǎn)運，包括PGD2及主效溶黃體素PGF2α[7]。

基于PGs可能在母畜繁殖中的重要作用，本研究以體外培養(yǎng)的綿羊卵泡顆粒黃體化細胞為基礎(chǔ)，利用qRT-PCR和ELISA技術(shù)分別檢測了不同組別中P4濃度及黃體消融關(guān)鍵基因(StAR、3β-HSD、PGFS、FP、HPGDS、DP)mRNA的表達量變化水平，為深入挖掘和探析哺乳動物黃體溶解調(diào)控機制奠定了堅實基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

哈薩克母羊來自新疆石河子屠宰場；20 ×PBS(生化Sangon Biotench公司)；胎牛血清(FBS，gibco公司)；DMEM-F12培養(yǎng)液(gibco公司)；胰蛋白酶(GIBCO公司)；雙抗(青霉素和鏈霉素，北京博奧托大科技有限公司)；LH(寧波三生生物科技有限公司)；FSH(寧波三生生物科技有限公司)；E2(Sigma公司)；PGD2(Cayman Chemical公司)；PGF2α(MACKLIN公司)；綿羊孕酮(P4)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(晶美公司)；總RNA提取試劑盒(TIANGEN公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(CWBIO公司)；TaKaRa試劑盒(TIANGEN公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 綿羊卵巢顆粒細胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)

在新疆石河子屠宰場采集無繁殖疾病、健康的哈薩克成年母羊優(yōu)質(zhì)卵巢，將卵巢周圍組織清理完畢，用含雙抗的1%PBS清洗干凈，在超凈臺用1 mL的注射器吸取卵泡液，放在含有完全培養(yǎng)液(85%DMEM-F12+15%FBS+1%雙坑)的培養(yǎng)皿中混勻，用100目篩過濾，1 000 r·min-1離心5 min，棄除上清，加入新的完全培養(yǎng)液，吹打混勻，接種到培養(yǎng)皿中，放置在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h觀察貼壁情況，待顆粒細胞達到80% ～ 90% 進行細胞傳代培養(yǎng)。首先將完全培養(yǎng)基倒掉，加入1% PBS進行清洗，加入2 mL胰消化酶進行消化5 min，待細胞變圓后加入2 mL完全培養(yǎng)液終止消化，用移液槍將細胞吹打下來，放在離心管中 1 000 r·min-1離心5 min，棄除上清，加入新的完全培養(yǎng)液，吹打混勻，接種到培養(yǎng)皿中，放置在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 綿羊卵巢顆粒細胞黃體化處理

待顆粒細胞傳代培養(yǎng)達到80%～90%，用無血清的DMEM-F12培養(yǎng)液饑餓處理12 h，再分別添加不同濃度的E2、FSH和LH。將試驗分成4組；第一組添加1 μg·mL-1E2、3 μg·mL-1FSH、10 μg·mL-1LH(E2(1 μg·mL-1)/FSH(3 μg·mL-1)/LH(10 μg·mL-1)組)；第二組添加2 μg·mL-1E2、3 μg·mL-1FSH、10 μg·mL-1LH(E2(2 μg·mL-1)/FSH(3 μg·mL-1)/LH(10 μg·mL-1)組)；第三組添加1 μg·mL-1E2、6 μg·mL-1FSH、15 μg·mL-1LH(E2(1 μg·mL-1)/FSH(6 μg·mL-1)/LH(15 μg·mL-1)組)；第四組無任何添加(顆粒細胞組)；分別收集4個組12、24、36、48、72 h的細胞液。使用ELISA檢測P4濃度，篩選出使顆粒細胞黃體化的最佳激素濃度及時間。

1.2.3 綿羊卵巢顆粒黃體化細胞添加PGD2、PGF2α處理

在顆粒細胞黃體化效果最佳的基礎(chǔ)上，將試驗分成四組，一組添加2 μg·mL-1PGF2α(PGF2α組)，二組添加2 μg·mL-1PGD2(PGD2組)，3組添加2 μg·mL-1PGD2和2 μg·mL-1PGF2α(PGD2+PGF2α組)，四組為無任何添加的顆粒黃體化細胞(對照組)，依據(jù)前期課題組實踐，添加到顆粒黃體化細胞中選擇最適宜的2 μg·mL-1添加劑量。分別收集各組6、12、24、36、48、72 h的細胞液，使用ELISA檢測P4濃度。

1.2.4 實時熒光定量(qRT-PCR)驗證

分別提取對照組、PGD2組、PGF2α組、PGD2+PGF2α組第24 h(添加PGD2、PGF2α、PGD2+PGF2α為第0 h)的總RNA，使用Nanodrop檢測RNA 的純度及濃度合格后，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20 ℃。qRT-PCR檢測的6個引物，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

表1 擴增引物信息詳情

最后進行qRT-PCR檢測StAR，3β-HSD，PGFS，F(xiàn)P，HPGDS和DP基因在mRNA水平的表達。qRT-PCR反應(yīng)為加入10 μL TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)，0.8 μL的下上引物，0.4 μL ROX Reference Dye(50×)，2 μL cDNA模板，6 μL ddH2O。將PCR條件設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)的兩步擴增程序，即在95 ℃下預(yù)變性30 s，然后進行PCR反應(yīng)，然后在95 ℃下進行40個循環(huán)5 s，在60 ℃下進行30～34 s。

1.2.5 統(tǒng)計分析

采用直線回歸方程和2-ΔΔct法進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)差異顯著性用SPSS 19.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 綿羊卵巢顆粒細胞黃體化結(jié)果及添加PGF2α和PGD2的結(jié)果

經(jīng)E2、FSH、LH處理后的顆粒細胞發(fā)生變化，結(jié)果顯示：在細胞形態(tài)上，綿羊的卵巢顆粒細胞大多數(shù)呈梭形，而顆粒黃體化細胞大多呈不規(guī)則三角形。在P4濃度水平上，相比顆粒細胞組，E2(1 μg·mL-1)/FSH(3 μg·mL-1)/LH(10 μg·mL-1)組和E2(2 μg/mL)/FSH(3 μg·mL-1)/LH(10 μg·mL-1)組在12、24、36、48、72 h 5個時間段變化不顯著(P>0.05)；E2(1 μg·mL-1)/FSH(6 μg·mL-1)/LH(15 μg·mL-1)組在12、36、48、72 h 變化不顯著(P>0.05)，但是在第24 h，E2(1 μg·mL-1)/FSH(6 μg·mL-1)/LH(15 μg·mL-1)組達到峰值，極顯著高于顆粒細胞組、E2(1 μg·mL-1)/FSH(3 μg·mL-1)/LH(10 μg·mL-1)組和E2(2 μg·mL-1)/FSH(3 μg·mL-1)/LH(10 μg·mL-1)組(P<0.01)(圖1)。結(jié)果表明：添加1 μg·mL-1E2、6 μg·mL-1FSH、15 μg·mL-1LH到顆粒細胞中，達到最佳黃體化效果，同時在其處理24 h時顆粒黃體化細胞合成分泌P4能力達到峰值，為后續(xù)試驗的順利進行提供保障。

圖1 E2/FSH/LH對顆粒細胞的影響

在顆粒細胞最佳黃體化效果的基礎(chǔ)上，無任何添加的顆粒黃體化細胞為對照組，添加PGF2α、PGD2、PGD2+PGF2α為試驗組，每組3個重復(fù)。結(jié)果顯示：在細胞形態(tài)上，顆粒黃體化細胞呈梭形或不規(guī)則狀；PGD2作用24 h的顆粒黃體化細胞形態(tài)發(fā)生改變，部分細胞出現(xiàn)輪廓模糊，萎縮凋亡；PGF2α作用24 h的顆粒黃體化細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，輪廓模糊，呈現(xiàn)圓形或塊狀結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)凋亡細胞的現(xiàn)象；PGD2+PGF2α作用24 h的顆粒黃體化細胞已觀察不到完整的結(jié)構(gòu)，輪廓模糊不清，呈現(xiàn)明顯凋亡和死亡現(xiàn)象。

在P4濃度水平上，在6、12、24、36、48、72 h 6個時間段，對照組、PGF2α組、PGD2組、PGD2+PGF2α組呈先上升后下降的趨勢；6 h、12 h、36 h、48 h、72 h時間段，對照組均高于PGF2α組、PGD2組、PGD2+PGF2α組，PGD2組均高于PGF2α組、PGD2+PGF2α組，PGF2α組高于PGD2+PGF2α組，但差異均不顯著(P>0.05)，在24 h，對照組顯著高于PGF2α組、PGD2組、PGD2+PGF2α組(P<0.01)(圖2)。結(jié)果說明PGD2、PGF2α、PGD2+PGF2α均溶解顆粒黃體化細胞，24 h的時候最佳，PGF2α溶解顆粒黃體化細胞效果高于PGD2，PGD2與PGF2α的共同作用效果更佳。

2.2 qRT-PCR檢測

StAR和3β-HSD是哺乳動物黃體形成、維持和退化的重要標(biāo)志性基因，可區(qū)別于顆粒細胞是否黃體化以及黃體溶解情況，結(jié)果顯示：相比于對照組，顆粒細胞組的StAR、3β-HSD表達量極顯著降低(P<0.01)；PGD2組和PGF2α組的StAR、3β-HSD表達量顯著降低(P<0.05)，PGD2+PGF2α組的StAR、3β-HSD表達量極顯著降低(P<0.01)(圖3)。結(jié)果證實顆粒細胞基本黃體化，PGF2α和PGD2均能夠促進體外卵巢顆粒黃體化細胞溶解，PGF2α和PGD2共同作用時，則在促溶黃體效應(yīng)中呈現(xiàn)出顯著地協(xié)同效應(yīng)。

圖3 StAR、3β-HSD在不同組別表達量

PGFS和FP分別是PGF2α合成的關(guān)鍵合成酶及其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的結(jié)合受體。結(jié)果顯示：相比于對照組，PGF2α組中的PGFS無明顯變化，PGD2組、PGD2+PGF2α組中的PGFS呈現(xiàn)極顯著上升變化(P<0.01)；PGD2組中的FP呈現(xiàn)顯著上升變化(P<0.05)，PGF2α組、PGD2+PGF2α組中的FP呈現(xiàn)極顯著上升變化(P<0.01)(圖4)。結(jié)果表明，添加PGF2α，可能抑制合成酶PGFS的生成，增加受體FP的生成，PGD2可能促進PGF2α合成酶PGFS的生成。

圖4 PGFS、FP在不同組別表達量

HPGDS與DP分別是PGD2合成的關(guān)鍵合成酶及其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的結(jié)合受體。結(jié)果顯示：相比于對照組，PGD2+PGF2α組中的HPGDS呈現(xiàn)顯著上升變化(P<0.05)，PGF2α組、PGD2組中的HPGDS呈現(xiàn)極顯著上升變化(P<0.01)；PGF2α組、PGD2組、PGD2+PGF2α組中的DP呈現(xiàn)極顯著上升變化(P<0.01)(圖5)。結(jié)果表明，添加PGD2，可能抑制合成酶HPGDS的生成，增加受體DP的生成，PGF2α可能促進PGD2合成酶生成。

圖5 HPGDS、DP在不同組別表達量

3 討論

3.1 綿羊卵巢顆粒細胞黃體化結(jié)果

黃體是雌性動物體內(nèi)重要的臨時器官，不僅調(diào)控發(fā)情周期長短，也對妊娠維持有著重要作用，是解決雌性動物繁殖問題的關(guān)鍵。然而，家畜體內(nèi)進行黃體研究存在時間以及技術(shù)方面的局限性和難度，且僅僅在黃體細胞進行研究很難真實模擬體內(nèi)顆粒細胞向黃體細胞發(fā)育所形成的一種內(nèi)分泌調(diào)控機制。顆粒細胞黃體化則在形態(tài)還是在功能上都類似于卵巢黃體細胞，還可以兼顧發(fā)情周期中卵泡向黃體發(fā)育的一個過程，對黃體溶解的研究有積極的作用。本試驗通過體外建立這種顆粒黃體化細胞體系，真實的模擬了顆粒細胞向黃體細胞轉(zhuǎn)化的過程。菅瑞珍研究證實，綿羊卵巢顆粒細胞添加1 μg·mL-1E2、2.5IU·mL-1FSH、2.5IU·mL-1LH在第24小時有顯著促進孕酮分泌的作用，使顆粒細胞成功黃體化[8]，這也與本試驗通過梯度篩選出綿羊卵巢顆粒細胞黃體化最佳濃度為1 μg·mL-1E2、6 μg·mL-1FSH、15 μg·mL-1LH，并在處理后第24小時P4濃度達到峰值相符，說明擬黃體化成功。因此，顆粒細胞體外培養(yǎng)黃體化的成功不僅對黃體生成的分子機制的研究具有重要意義，也為后期在顆粒細胞擬黃體化基礎(chǔ)上進行的試驗的成功提供了保障。

3.2 PGF2α、PGD2對卵巢顆粒黃體化細胞溶解及相關(guān)基因差異表達的影響

PGF2α是啟動黃體溶解的關(guān)鍵因素[9]。本試驗在PGF2α在黃體溶解已有的研究基礎(chǔ)上，探討前列腺素家族的另一位成員PGD2可能對黃體的作用以及和PGF2α在黃體溶解中的互作[10]。黃體主要的功能是分泌P4，當(dāng)P4分泌到一定量，對下丘腦、垂體產(chǎn)生負反饋作用，抑制FSH的生成和卵泡發(fā)育，動物不再發(fā)情[11]。因此，P4是顆粒細胞黃體化的重要標(biāo)志，通過檢測P4的含量，可以大體推測出顆粒細胞黃體化程度以及溶解程度。本試驗結(jié)果顯示，在黃體化的基礎(chǔ)上，添加PGF2α、PGD2、PGD2+PGF2α的組在第24 h P4濃度極顯著降低，說明PGF2α、PGD2、PGD2+PGF2α均溶解黃體，溶解效果PGD2+PGF2α明顯高于PGF2α，PGF2α明顯高于PGD2，從細胞外部形態(tài)也可以證實這一點。目前，由顆粒細胞向黃體化轉(zhuǎn)變的中間階段相關(guān)研究鮮有報道，因此本試驗檢測顯示在24 h PGF2α、PGD2、PGD2+PGF2α溶解效果達到最佳其結(jié)果有待進一步考證。圖1和圖2 P4濃度出現(xiàn)了差異，這可能由兩方面造成的，一方面是由于本試驗在摸索出顆粒細胞黃體化的最佳的條件的基礎(chǔ)上，再次培養(yǎng)新的顆粒細胞在添加1 μg·mL-1E2、6 μg·mL-1FSH、15 μg·mL-1LH 24 h黃體化時添加不同前列腺素開始算時間，因此可能造成圖1和圖2 P4濃度差異；另一方面可能是由于檢測激素濃度時使用的試劑盒是不同批次或兩次操作過程中造成P4濃度差異。大量研究證實，StAR的出現(xiàn)與P4的合成在時空上有一致性，StAR和3β-HSD是黃體的功能指標(biāo)之一[12]。同時，另有研究發(fā)現(xiàn)，使用PGF2α處理大鼠4小時后，血清P4濃度顯著下降，3β-HSD蛋白及其mRNA水平下降50%～60%；8 h后，3β-HSD蛋白及其mRNA回到正常水平[13]。而在本試驗中，PGD2組和PGF2α組的StAR、3β-HSD表達量顯著降低(P<0.05)，PGD2+PGF2α組的StAR、3β-HSD表達量極顯著降低(P<0.01)，表明PGF2α、PGD2和PGD2+PGF2α均能夠使體外卵巢顆粒黃體化細胞溶解，PGF2α和PGD2協(xié)同效果更佳。PGFS和HPGDS分別是PGF2a和PGD2合成的關(guān)鍵性酶，而前列腺素只有通過與各自的受體結(jié)合才能發(fā)揮作用[14]。有研究報道，PGF2α可以激活分布在黃體中的FP導(dǎo)致黃體細胞凋亡、最終實現(xiàn)黃體溶解[15]。PGD2通過與DP相互作用引發(fā)其生物學(xué)作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)添加PGF2α不僅能夠抑制合成酶PGFS的生成，還能增加受體FP的生成，PGD2則可以促進PGF2α合成酶生成；發(fā)現(xiàn)添加PGD2，不僅能夠抑制合成酶HPGDS的生成，增加自身受體DP的生成，也能協(xié)助PGF2α更佳有效的溶解顆粒黃體化細胞。

總之，本試驗驗證了母畜的卵巢顆粒細胞黃體化過程不僅受主效溶黃體PGF2α的影響，同時PGs家族成員中PGD2也會單獨參與或協(xié)同PGF2α共同影響卵巢顆粒細胞向黃體細胞轉(zhuǎn)化的進程。

本試驗在體外培養(yǎng)的綿羊卵巢顆粒細胞通過添加1 μg·mL-1E2、6 μg·mL-1FSH、15 μg·mL-1LH在24 h達到黃體化。在哺乳動物中，PGD2和PGF2α均參與了卵巢顆粒細胞向黃體細胞轉(zhuǎn)化的調(diào)控過程；同時，PGD2和PGF2α之間可能存在協(xié)同效應(yīng)，共同影響其顆粒細胞黃體化進程。這為深入探究和全面認識哺乳動物卵巢排卵向黃體的形成轉(zhuǎn)化機制奠定了堅實基礎(chǔ)。