李靖，董良杰，崔彥如，趙葉明，趙勝楠，高海，何自涵

(1 吉林農業(yè)大學工程技術學院，吉林 長春 130118；2 吉林省農業(yè)科學院，吉林 長春 130124；3 南充市農業(yè)科學院，四川 南充 637000)

秸稈是世界上最為豐富的物質之一,是糧食作物和經濟作物生產中的副產物，其中含有豐富的氮、磷、鉀、微量元素等成分。我國年產農作物秸稈7億多噸，約占世界年秸稈產量的30%[1]，其中玉米秸稈2.5億噸，東北地區(qū)年玉米產量1億噸以上，年產秸稈達1.1噸左右，占全國玉米秸稈資源的40%～50%。玉米秸稈含有豐富的碳水化合物、礦物質及粗蛋白等營養(yǎng)成分，玉米秸稈中60%以上的碳水化合物、2%～4%的蛋白質、0.5%～1%的脂肪，纖維素、半纖維素與木質素約占38%、24%、18%，是一種可供開發(fā)與綜合利用的資源之一[2]。全國至少仍有1/3的秸稈沒有被合理的利用，我國大多采用直接燃燒的方式進行處理，由此帶來環(huán)境污染、火災事故、土壤礦化等一系列問題。

吉林省作為我國重要的糧食生產基地，玉米是主要的農業(yè)作物，據(jù)2015年統(tǒng)計，吉林省玉米秸稈年產量4 000萬噸，其中肥料化還田占40%～55%，12%～15%用于飼料化(部分畜牧養(yǎng)殖區(qū)比例上浮)，8%～12%用于燃料化(包括農村冬季取暖)，1%～3%用于基料化，仍有近30%以上沒有實現(xiàn)資源化利用，大量的玉米秸稈直接焚燒，一方面造成資源浪費，另一方面也造成大量的區(qū)域污染[3]。玉米秸稈成分結構致密，其所含的纖維素、半纖維與木質素更是難以被微生物降解，在自然條件下降解玉米秸稈則需要很長一段時間[4]，要在厭氧發(fā)酵前進行預處理工作，根據(jù)目前研究現(xiàn)狀分析，利用微生物預處理玉米秸稈水解玉米秸稈中的有機物質已成為一種有效的解決辦法。微生物預處理技術是利用外加的具有生物活性的酶，利用單一的菌株或復合的菌群在前期預處理中加快玉米秸稈的分解，利用微生物預處理技術后不僅能降低耗能、避免二次污染，還可以在后續(xù)厭氧發(fā)酵過程中產生一定的促進作用，而且對于纖維素、半纖維素與木質素也可起到一定的降解作用[5]。

本文將采用乳酸菌、EM菌劑、黑曲霉、白腐菌、草酸青霉及木霉，共計6中微生物菌劑復合用于玉米秸稈的前期預處理試驗中，通過試驗以期達到玉米秸稈的高效水解與高效的厭氧發(fā)酵產氣的技術，為農業(yè)廢棄物的資源化、能源化利用提供新的解決措施。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米秸稈：取自吉林省農科院玉米試驗田，經過田間自然曬干，后經過揉搓曝氣處理，使粒徑為0.7～1 cm。玉米秸稈預處理微生物：來自市面上出售的乳酸菌、EM菌、黑曲霉、白腐菌、草酸青霉及木霉經過微生物培養(yǎng)后接種使用。牛糞：取自吉林省農科院畜牧分院養(yǎng)殖場。試驗原料與接種物基本性質如表1所示。

表1 試驗原料與接種物基本性質

1.2 試驗裝置與儀器

1.2.1 試驗裝置

本試驗主要可分為微生物預處理試驗與厭氧發(fā)酵產氣試驗兩部分，且兩部分均獨立完成。微生物預處理試驗是將培養(yǎng)后的乳酸菌、EM菌、黑曲霉、白腐菌、草酸青霉及木霉與揉搓曝氣處理后的玉米秸稈按比例混合后室溫下25 ℃條件下進行儲存。厭氧發(fā)酵產氣階段將采用自制厭氧發(fā)酵產氣系統(tǒng)，如圖1所示，使其在35 ℃、TS為15%的條件下進行中溫發(fā)酵。

圖1 厭氧發(fā)酵產氣試驗裝置

1.2.2 試驗儀器設備

島津分析天平AUY系列 AUY220電子分析天平(日本島津有限公司)、DHP-9402電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海華零實業(yè)有限公司)、FEI Quanta FEG 650 掃描電子顯微鏡(賽默飛材料與結構分析電鏡事業(yè)部)、TGL-16G 高速冷凍離心機(金壇市精達儀器制造有限公司)、HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市精達儀器制造有限公司)、101系列 數(shù)顯鼓風干燥箱(北京東信力搏科技有限公司)、i7 紫外可見光光度計(濟南海能儀器股份有限公司)、DZS-708型 多參數(shù)分析儀(上海儀電科學儀器股份有限公司)、HW-1340 超凈工作臺(東莞市弘維凈化科技有限公司)、YXQ-LS-75SII 立式蒸汽壓力滅菌器(北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司)、GC-2014C氣相色譜(日本島津有限公司)。

1.3 試驗方法與設計

1.3.1 菌劑的預處理

(1)培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：稱取39 g固體培養(yǎng)基粉末溶于1 L水中，121 ℃滅菌15 min。

(2)菌種培養(yǎng)。孢子懸浮液的制備：將以上菌種活化后移至PDA平板上，于30 ℃培養(yǎng)4～6 d，至長滿孢子時用用無菌水沖洗至三角瓶中，加入滅菌玻璃珠，在200 r·min-1的振蕩器中震蕩30 min，取出，利用血球計數(shù)板計數(shù)[6]，調整至每種菌種的孢子數(shù)在106mL-1。

復合微生物菌劑CM-2：將以上菌種的孢子懸浮液按照體積比為1∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合。

復合微生物預處理玉米秸稈：每1 kg上述揉搓曝氣處理后的玉米秸稈接種80 mL上述制備好的復合微生物菌劑，室溫25 ℃儲存。空白對照組則采用揉搓曝氣處理后的玉米秸稈，其他不做任何處理，室溫25 ℃。

1.3.2 試驗設計

經過復合微生物菌劑預處理后的玉米秸稈保存30 d，每天設置2個重復共3組平行試驗，空白對照試驗組選取經過上述揉搓曝氣處理后的同一批玉米秸稈并且不添加任何微生物菌劑與其它處理的條件下重復上述過程。室溫下保存，每天取樣，共計30天，分別對其pH、還原糖、纖維素、半纖維素與木質素進行測定。

厭氧發(fā)酵產氣階段是將每天處理后的玉米秸稈與新鮮牛糞，按照干物質比為1∶2，TS為15%，發(fā)酵溫度為35 ℃，加入經過充分發(fā)酵后的沼液調節(jié)至有效體積至0.8 L，進行35 d中溫批次厭氧發(fā)酵試驗?？瞻讓φ战M的厭氧發(fā)酵產氣原料取自上述預處理試驗中的空白對照組的玉米秸稈重復上述處理步驟。每組試驗設置3組平行試驗，每隔2 d測定其產氣量與氣體成分。

1.4 分析方法

TS、VS 測定參照重量測定方法。利用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[7]與紫外分光光度計測定預處理后的玉米秸稈的還原糖；使用多參數(shù)分析儀測定不同預處理時間后的玉米秸稈的pH 值[8]；纖維素、半纖維素、木質素采用洗滌滴定法[9]。采用排水集氣法收集氣體，每隔2天定時測量厭氧反應器中排出的水量，即為沼氣的產氣量(mL)，同時利用氣相色譜儀對產氣進行分析。

2 結果與分析

2.1 復合微生物菌劑預處理

2.1.1 復合微生物菌劑預處理玉米秸稈不同時間對pH變化的影響

經過復合微生物菌劑CM-2以及空白對照組的預處理后的玉米秸稈測定其在不同處理天數(shù)時的pH值，如圖2所示，經過復合微生物菌劑CM-2處理的玉米秸稈其pH變化基本呈現(xiàn)先迅速下降后趨于穩(wěn)定的狀態(tài)，而空白對照組的玉米秸稈其pH值基本保持穩(wěn)定。經過復合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈其pH從開始的6.8下降至后期的3.9，說明經過復合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈在預處理期間進行了部分水解，有乙酸等揮發(fā)性酸的產生，第3天～第21天，pH下降速率快，說明在此過程中有酸性物質的積累，至第21天～第29天時，能被復合微生物菌劑CM-2消耗的有機質成分以基本消耗完畢，同時水解產生的酸類物質也為后續(xù)的厭氧發(fā)酵提供了物質基礎。

圖2 玉米秸稈pH變化圖

2.1.2 復合微生物菌劑預處理玉米秸稈對纖維素、半纖維素與木質素含量的影響

纖維素主要是由葡萄糖分子通過1,4-β糖苷鍵鏈接聚合而成的高分子化合物，水解多產生葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶[10]，在生產過程中屬于較易被處理部分；半纖維素則是由除了葡萄糖以外還有木糖、半乳糖、甘露糖等成分構成[6]，其中以木糖的水解較為復雜，需要經過兩次或兩次以上的水解才可將大分子糖類轉化為小分子的葡萄糖等物質，屬于較難被降解有機物質；而木質素結構較為復雜，一般則認為木質素主要苯丙烷單元通過醚鍵和C-C鍵連接而成的聚酚類三維網狀高分子芳香族化合物，難以被降解處理[11]。本次試驗使玉米秸稈在經過復合微生物菌劑CM-2預處理后其纖維素降解率達到52.94%，半纖維素降解率達33.33%，而難以被降解的木質素其降解率也可達到2.67%(圖3)，這說明經過復合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈產生了能夠促進纖維素、半纖維素與木質素水解的酶，在將大分子有機物水解的同時，也保障了后期厭氧發(fā)酵的產氣效率。

圖3 復合微生物菌劑預處理玉米秸稈纖維素、半纖維素與木質素含量的變化

2.2 復合微生物菌劑預處理玉米秸稈對厭氧發(fā)酵產氣的影響

2.2.1 產氣量的影響

由于空白對照組在厭氧產氣發(fā)酵試驗階段發(fā)酵原料能夠正常維持厭氧發(fā)酵所需的有機物質，且有合適的碳氮比與發(fā)酵溫度，故而能使空白對照組正常產氣并且可作為經過復合微生物菌劑CM-2處理組的產氣對照組。本次試驗設定發(fā)酵周期為35 d，經過復合微生物菌劑CM-2預處理后的玉米秸稈其產氣能力與未經處理的空白對照組之間的產氣能力有很大的差異，通過測定其開始產氣時間、進入產氣高峰時間和維持產氣高峰期的時間發(fā)現(xiàn)經過復合微生物菌劑CM-2預處理后的玉米秸稈在第1 d已經開始有產氣，較空白對照組提前了2 d，此外，經過微生物處理組在第13 d開始進入產氣高峰期，且維持時間長，進入產氣高峰天數(shù)達14 d；相比而言，空白對照組則是在第17 d開始進入產氣高峰且維持時間短，僅維持6 d(圖4)。這一現(xiàn)象則說明，經過復合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈對提前產氣與增長產氣高峰時間上都有良好的促進作用，進而提高玉米秸稈能源化的轉化。

圖4 厭氧發(fā)酵日產氣量

2.2.2 累積產氣量的影響

兩組試驗在經過35 d厭氧產氣發(fā)酵后的累積產氣量如圖5所示。

圖5 厭氧發(fā)酵累積產氣量

經過35 d的厭氧發(fā)酵，微生物預處理后的玉米秸稈的累積產氣量可達7 170 mL，而空白對照組的累積產氣量則為5 006 mL，兩組試驗累積產氣量的差異極顯著(P<0.01)，綜合比較，經過復合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈在經過厭氧產氣發(fā)酵后的累積產氣量要比空白對照組的高30.18%，效果明顯，說明復合微生物菌劑CM-2預處理玉米秸稈對厭氧發(fā)酵的高效運行有明顯的促進作用。

2.2.3 甲烷含量的影響

本次的兩組試驗在每次測定產氣量的同時，測定其甲烷的體積分數(shù)，經過35 d 的厭氧產氣發(fā)酵，兩組試驗的甲烷體積分數(shù)的變化如圖6所示，經過復合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈在厭氧產氣第11 d時，其甲烷體積分數(shù)為37.765 4%，已經接近40%，并且甲烷體積分數(shù)超過40%的天數(shù)能夠維持到第29 d，且甲烷體積分數(shù)最高還可達到77.096 43%，這說明在此段反應時間有足夠的厭氧反應所需的有機物質來供給厭氧發(fā)酵，維持厭氧反應過程的高效運行，相比來看，空白對照組則在反應開始后的第15 d時，甲烷的體積分數(shù)才達到40%以上，并且甲烷體積分數(shù)維持在40%以上的天數(shù)僅有10 d，經過兩組試驗對比來看，可以說明經過復合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈在厭氧發(fā)酵過程中對于甲烷的轉化率高。

圖6 厭氧發(fā)酵甲烷含量

3 討論

我國秸稈資源豐富，其中玉米秸稈中含有豐富的有機物質，其主要由碳水化合物、蛋白質、脂肪，纖維素、半纖維素與木質素約組成[2]，但由于纖維素、半纖維素和木質素難以被直接的水解，若不經過預處理直接進行厭氧發(fā)酵處理其有機物質應用效率較低，故而將采取預處理措施，增加纖維素、半纖維素與木質素的水解，進而對后續(xù)厭氧發(fā)酵起到促進作用[12]。

1)揉搓曝氣預處理與微生物預處理相結合可有效破壞纖維素、半纖維素與木質素，加快水解。常娟等[13]對玉米秸稈采用蒸汽爆破的方法，然后再進行單一米曲霉的預處理試驗中，將進過蒸汽爆破處理后的玉米秸稈與米曲霉混合預處理6 d后，其纖維素與半纖維素的降解率可達27.89%和64.80%，而只進行爆破處理的玉米秸稈其纖維素的降解率只有8.47%。而高贊等[14]利用黑曲霉、綠色木霉等混合后的復合菌對玉米秸稈進行預處理研究試驗中，經過15 d的預處理周期，玉米秸稈中的纖維素、半纖維素的降解率可達48.53%、36.38%。本文研究采用將玉米秸稈揉搓曝氣預處理與復合微生物菌劑CM-2相結合，經過30 d預處理周期，與直接經過揉搓曝氣預處理后的玉米秸稈相比，纖維素半纖維素的降解率可達52.94%和33.33%，并且木質素的降解率也有2.67%。由此可知，經過揉搓曝氣與復合微生物菌劑CM-2預處理后的玉米秸稈可以有效提高玉米秸稈中纖維素與半纖維素的水解。

2)玉米秸稈中的有機物質在經過預處理后能夠更好的在厭氧發(fā)酵過程中被應用，黃文博等[15]利用白腐菌對玉米秸稈進行前期預處理以提高沼氣產氣量研究中，經過白腐菌處理后的玉米秸稈在厭氧發(fā)酵試驗中的累積產氣量較未經白腐菌處理的空白對照組提高了12.32%；趙肖玲等[16]利用黑曲霉與木霉復合菌劑處理秸稈提高產甲烷性能研究中發(fā)現(xiàn)，經過微生物處理后的玉米秸稈在進行厭氧發(fā)酵時其累積產氣量較未經微生物處理的對照組提高了10.06%；黃開明[17]等人利用黑曲霉、木霉、草酸青霉和白腐菌對玉米秸稈進行前期預處理以提高產氣性能研究中，經過復合微生物預處理后的玉米秸稈其累積產氣量比未經復合微生物預處理的對照組提高了27.4%，并且在第4 d時，甲烷含量達到40%以上。本文試驗表明，在經過復合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈在厭氧產氣發(fā)酵試驗中累積產氣量有明顯提升，經過35 d的厭氧發(fā)酵，累積產氣量提高了30.18%。因此經過復合微生物菌劑處理后的玉米秸稈在水解纖維素半纖維素與木質素的同時，在適當?shù)膮捬醢l(fā)酵環(huán)境中可以獲得較高的甲烷產氣量，從而提高玉米秸稈資源的利用。

4 結論

本次試驗利用復合微生物菌劑CM-2預處理玉米秸稈，可使玉米秸稈的纖維素降解52.94%、半纖維素降解33.33%、木質素降解2.67%，對經過復合微生物菌劑CM-2預處理后的玉米秸稈與牛糞按照1∶2的比例，在35 ℃條件下進行35 d的厭氧產氣發(fā)酵其累積產氣量提高30.18%，并且采用復合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈其產氣效率有明顯的增加并且產氣高峰期時間可延長至14 d且在產氣高峰時的甲烷轉化率也提高了12.87%。

綜上所述，利用復合微生物菌劑CM-2處理玉米秸稈在降解纖維素、半纖維素與木質素的同時，實現(xiàn)了在中低溫條件下，厭氧產氣效率的提高，增加了玉米秸稈中的有機物質轉化為甲烷的能力，為秸稈資源能源化的推進提供了良好的解決方法。此外，本次研究所采用的厭氧發(fā)酵濃度可達15%，屬于干法發(fā)酵，此種方式更適于應用在北方寒冷地區(qū)，對北方寒冷地區(qū)沼氣工程的推進起到一定的促進作用，并且還為玉米秸稈在預處理方式上提供了新的高效處理方法。