李小雅,譚周進

李小雅,譚周進,湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南省長沙市 410208

0 引言

近年來,中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)治療疾病中發(fā)揮重要作用,以中醫(yī)藥為靶點,選擇合理的研究技術(shù)有利于全面了解腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和作用,充分挖掘其潛在價值.謝果珍等[1]對小鼠腸內(nèi)容物中乳酸菌、雙歧桿菌及大腸桿菌進行微生物培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn),鐵皮石斛多糖可調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群發(fā)揮“益生元”作用.王永安等[2]發(fā)現(xiàn)大承氣湯可調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性,恢復(fù)腸道細菌群落,達到治療過敏性哮喘的效果.何云山等[3]發(fā)現(xiàn)保和丸治療后食積小鼠腸道內(nèi)容物及腸黏膜中木聚糖酶、淀粉酶以及蛋白酶的活性下降,揭示保和丸對食積小鼠的腸道酶活性的調(diào)節(jié)作用.唐圓等[4]發(fā)現(xiàn)痛瀉要方能夠使小鼠腸道內(nèi)容物中微生物活度降低,腸黏膜微生物活度增加,初步闡明痛瀉要方對肝氣乘脾泄瀉小鼠腸道微生物活度的作用機制.體外模擬實驗可在一定程度上還原胃腸道狀態(tài),在探究葛根芩連湯在模擬胃腸液中對微生物生長的影響時發(fā)現(xiàn)[5],葛根芩連湯在模擬胃腸液中對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌均有較好的抑制效果,且隨消化時間延長對各個細菌的抑制效果發(fā)生變化.本文將從微生物培養(yǎng)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、酶學(xué)技術(shù)等方面概述中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)領(lǐng)域的應(yīng)用進展,為利用腸道微生態(tài)研究中醫(yī)藥理論及其應(yīng)用提供方法學(xué)思路(見表1).

1 微生物培養(yǎng)計數(shù)法在中醫(yī)藥調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)研究中的應(yīng)用

腸道微生物培養(yǎng)是較為傳統(tǒng)的微生物鑒定方法.中醫(yī)藥利用微生物培養(yǎng)技術(shù)在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)治療疾病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用.龍承星等[19]對脾虛便秘及灌胃鐵皮石斛多糖后小鼠腸內(nèi)容物中乳酸菌、雙歧桿菌、大腸桿菌進行微生物培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖明顯恢復(fù)了大腸桿菌的菌落數(shù),乳酸菌和雙歧桿菌明顯減少,總數(shù)顯著超過正常組,提示鐵皮石斛多糖在一定程度上能扶植乳酸菌和雙歧桿菌等有益菌,抑制大腸桿菌等有害菌,調(diào)控脾虛便秘小鼠腸道微生態(tài)平衡,優(yōu)化腸道環(huán)境,改善脾虛便秘癥狀.唐標(biāo)等[20]在探究降脂理肝湯對高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝大鼠腸道微生物的影響時,發(fā)現(xiàn)降脂理肝湯能夠抑制腸道細菌、大腸桿菌及乳酸菌的生長,使細菌總數(shù)和乳酸菌數(shù)量恢復(fù)至正常組水平,表明降脂理肝湯能調(diào)整非酒精性脂肪肝大鼠腸道菌群種群,改善腸道微環(huán)境紊亂的現(xiàn)象,達到治療效果.腸道微生物培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)逐漸深入到中醫(yī)藥調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)治療疾病的各個方面,選擇符合培養(yǎng)條件的培養(yǎng)基對腸道中的細菌進行培養(yǎng),通過檢測腸道細菌數(shù)量變化初步衡量腸道菌群是否在疾病發(fā)生發(fā)展過程中及中藥干預(yù)治療后發(fā)揮作用,明確中醫(yī)藥作用的可培養(yǎng)菌類,為進一步從微觀角度探索中醫(yī)藥調(diào)節(jié)腸道菌群治療疾病的機制研究,為相關(guān)純化及菌劑研究提供更為直接的證據(jù).另外,微生物培養(yǎng)過程復(fù)雜,對分離物很難進行精確鑒定,導(dǎo)致研究微生物多樣性的真實概況受到限制.鑒于此,我們可通過優(yōu)化培養(yǎng)條件、改善培養(yǎng)基營養(yǎng)并綜合其他分子技術(shù),有助于評定特定腸道共生菌的功能,進一步闡述有益菌和致病菌之間的相互作用,為挖掘腸道微生物益生功能及抗病功能奠定基礎(chǔ).

2 分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)研究中的應(yīng)用

2.1 基于核酸的分析技術(shù)

2.1.1 變性/溫度梯度凝膠電泳技術(shù):變性/溫度梯度凝膠電泳(denaturing/temperature gradient gel electrophoresis,DGGE/TGGE)技術(shù)可直接分析樣品總DNA的微生物多樣性,在揭示微生物群落遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯優(yōu)越性[21].鄺棗園等[22]應(yīng)用DGGE分析探討黃連解毒湯對高脂血癥小鼠腸道微生態(tài)的影響時,對各組小鼠腸道糞便的細菌群落進行聚類分析發(fā)現(xiàn)各組小鼠腸道菌群都建立了新的細菌群落結(jié)構(gòu),但部分組別細菌群落結(jié)構(gòu)仍不穩(wěn)定.而黃連解毒湯組可能從抑制腸道中某些細菌的生長方面,調(diào)節(jié)腸道形成新的、相對穩(wěn)定的細菌群落結(jié)構(gòu),從而干預(yù)脂質(zhì)代謝過程治療高脂血癥.楊澤銳等[23]從相似性系數(shù)角度分析紅景天破壁飲片對小鼠腸道菌群影響時,發(fā)現(xiàn)在聚類分析中,各劑量組破壁飲片以及常規(guī)飲片組的組內(nèi)相似度都會明顯改變,說明服用破壁飲片和常規(guī)飲片之后比較有可能形成穩(wěn)定的腸道菌群環(huán)境.應(yīng)用DGGE/TGGE技術(shù)我們可以從對比不同微生物群落之間的差異變化方面,探究中醫(yī)藥在疾病的治療過程可能的機制研究,對腸道微生物的群落的結(jié)構(gòu)、功能和動態(tài)變化有著更好的闡述,為全面、快速、準(zhǔn)確分析和鑒定復(fù)雜的腸道微生物提供新的方向.

表 1 腸道微生態(tài)研究技術(shù)

2.1.2 末端限制性片段長度的多態(tài)性技術(shù):末端限制性片段長度的多態(tài)性(terminal-restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)技術(shù)以分子系統(tǒng)學(xué)原理為基礎(chǔ),運用了PCR、限制性酶切、熒光標(biāo)記和 DNA 序列分析等技術(shù),通過對特定核酸片段長度多態(tài)性的測定來分析微生物群落結(jié)構(gòu)和功能[24].Wu等[25]采用T-RFLP技術(shù)研究甘草中類黃酮異黃酮苷元調(diào)節(jié)結(jié)腸炎相關(guān)大腸癌(colitis-associated colorectal cancer,CAC)腸道菌群影響時,發(fā)現(xiàn)甘草中類黃酮異黃酮苷元改變了小鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu),其中Lachnospiraceae、Rikenellaceae含量降低、Helicobacteraceae含量增加,證明甘草中類黃酮異黃酮苷元可保護小鼠免受CAC的侵害,且它和腸道菌群可能具有協(xié)同的抗癌作用.與定性分析的DGGE/TGGE技術(shù)不同,T-RFLP技術(shù)可定性、定量分析微生物群落結(jié)構(gòu)和功能.應(yīng)用T-RFLP技術(shù)在短時間內(nèi)對腸道中細菌群落以及群落中細菌組成定量分析,證實中藥對疾病主要調(diào)控作用的腸道細菌靶點,為中藥可能通過調(diào)節(jié)腸道微生物群來預(yù)防疾病發(fā)生發(fā)展提供新的證據(jù).

2.1.3 擴增核糖體DNA限制性酶切片段分析技術(shù):擴增核糖體DNA 限制性酶切片段分析(amplifed ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)技術(shù)是一種快速、有效的現(xiàn)代生物鑒定方法,在微生物遺傳多樣性及其分類研究中應(yīng)用廣泛[26].郭抗蕭等[27]采用ARDRA技術(shù)研究七味白術(shù)散對菌群失調(diào)腹瀉小鼠腸道菌群多樣性的影響時發(fā)現(xiàn),乳酸桿菌16S rDNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后傳統(tǒng)湯藥(七味白術(shù)散)組與模型組相比ARDRA條帶增加,且接近于正常組,提示造模后小鼠腸道菌群失調(diào),乳酸桿菌量減少,多樣性下降;七味白術(shù)散治療后可改變小鼠腸道菌群多樣性,與正常組群落結(jié)構(gòu)的相似性系數(shù)接近.根據(jù)ARDRA條帶的豐富程度,我們可以看出腸道菌群群落的多樣性,且ARDRA條帶信號越強,表示腸道菌群中該物種的數(shù)量越多.從實驗結(jié)果中證實了七味白術(shù)散能夠促進乳酸桿菌的生長,增加乳酸桿菌的豐富度,為今后七味白術(shù)散應(yīng)用于臨床提供了新的方向.ARDRA技術(shù)能夠在一定程度上反映出核糖體DNA的遺傳多樣性,通過ARDRA技術(shù)應(yīng)用中醫(yī)藥領(lǐng)域的腸道微生態(tài)研究對微生物鑒定、共生菌、病原菌的微生物遺傳多樣性的檢測,了解疾病過程中破壞腸道微生態(tài)的主要影響因素,以及建立中醫(yī)藥良性、穩(wěn)定的腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)具有重要意義,為今后開發(fā)有利于特異性中藥抑制劑具有重要的實際應(yīng)用價值.

2.1.4 基因芯片技術(shù):基因芯片(Gene chip)技術(shù)又稱DNA微陣列,能快速、準(zhǔn)確、大規(guī)模地對獲取樣品核酸序列信息進行定性分析.Gene chip技術(shù)已應(yīng)用于糞便、環(huán)境樣本等的眾多領(lǐng)域中,主要應(yīng)用于基因表達分析、基因組測序、疾病診斷及藥物篩選等方面[28].周鴻雲(yún)[29]在用Gene chip技術(shù)探索人參烏梅湯加味對腹瀉模型大鼠結(jié)腸差異基因的分子調(diào)控機制發(fā)現(xiàn),有17個基因表達上調(diào),34個基因表達下調(diào),提示中藥對腹瀉的調(diào)控是多層次、多靶點的.Gene chip技術(shù)不僅可以從基因?qū)用娉醪浇沂局嗅t(yī)藥應(yīng)用腸道微生態(tài)治療疾病的分子機制.而且由于不同基因存在不同功能,參與不同的信號通路,涉及疾病的多個階段多個環(huán)節(jié),互相之間存在著復(fù)雜的交互網(wǎng)絡(luò)作用關(guān)系,它們可能單個發(fā)揮作用,可能需要多個基因同時參與某條通路或表達某項功能.基于此,我們也可以深入“中藥組分-信號通路-調(diào)控”的新視角,宏觀與微觀結(jié)合系統(tǒng)研究中藥復(fù)方多成分、多靶點、多途徑作用機制,為進一步詮釋中醫(yī)藥應(yīng)用腸道微生態(tài)治療疾病的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵奠定基礎(chǔ).

2.1.5 熒光原位雜交技術(shù):熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization,FISH) 技術(shù)對不同類群的微生物在細胞水平上進行原位的定性定量分析,描述微生物的形態(tài)特征、豐度以及在樣品上的空間分布和動態(tài)[30].應(yīng)用FISH技術(shù)探究中藥多糖調(diào)節(jié)抗生素菌群失調(diào)小鼠腸道菌群變化時發(fā)現(xiàn)[31],中藥多糖組中小鼠腸道雙歧桿菌的含量較模型組升高,大腸桿菌的含量降低,提示中藥多糖具有扶植腸道正常菌群生長的作用.實驗中經(jīng)中藥多糖干預(yù)后快速有效地通過大腸桿菌探針對金葡菌、雙歧桿菌等進行雜交檢測,得到中藥多糖可通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)及豐度達到治療抗生素引起菌群失調(diào)的現(xiàn)象.FISH方法在檢測中醫(yī)藥調(diào)節(jié)菌群失調(diào)的應(yīng)用較傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法具有明顯的優(yōu)勢,不僅能夠?qū)Χ喾N微生物進行定性定量檢測,而且能夠分析微生物群落及對特定菌群進行空間定位和原位生理學(xué)研究,提高了腸道菌群檢測的速度和種類變化的準(zhǔn)確度,有助于對中藥發(fā)揮療效功能進行準(zhǔn)確、客觀的評價,對中藥的開發(fā)提供技術(shù)支持.

2.1.6 實時熒光定量PCR技術(shù):實時熒光定量PCR(realtime quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)即應(yīng)用RT-PCR檢測系統(tǒng)對實驗反應(yīng)過程中熒光信號的強度進行檢測,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析.該技術(shù)能夠分析明確腸道中某類有益菌和致病菌的定植規(guī)律,逐漸應(yīng)用于人類以及動物腸道特定菌群的分析檢測[32].在探究安腸湯治療潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)作用機制過程中,孫平良[33]應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測大鼠腸內(nèi)容物中各菌屬基因表達,發(fā)現(xiàn)安腸湯對UC大鼠腸道菌屬有明顯的調(diào)節(jié)作用.曾藝鵬等[34]在探究葛根芩連湯治療2型糖尿病濕熱證對患者腸道菌群影響時發(fā)現(xiàn),葛根芩連湯在一定程度上改善了腸道微生態(tài),能有效抑制致炎細菌、促進益生菌的生長,從而達到治療2型糖尿病濕熱證的效果.RTPCR技術(shù)不僅可以從基因水平的量化檢測來描述中藥對腸道微生物的特定效應(yīng),而且可以對中藥干預(yù)治療后腸道中某些有益菌和致病菌的定植規(guī)律進行定量分析,這充分顯現(xiàn)出腸道菌群中醫(yī)藥治療疾病過程中的重要地位,日益凸顯中醫(yī)藥在腸道菌群結(jié)構(gòu)及細菌定量、病原檢測、基因表達等方面的優(yōu)越性.

2.1.7 高通量測序技術(shù):高通量測序(high-throughput sequencing,HTS)技術(shù)能夠以樣品中各微生物基因組信息作為研究對象直接進行微生物組成的分析,可準(zhǔn)確獲得腸道微生物群落信息[35].而測序技術(shù)的發(fā)展由于測序原理、測序平臺的不同也出現(xiàn)了較大的差異.其中二代測序可對多個樣本進行測序,在單位時間內(nèi)數(shù)據(jù)測序通量及產(chǎn)出量增長.與二代測序不同的是,三代測序技術(shù)測序過程更加簡化,讀長變長,可對16S rRNA基因全長進行測序,直接對給定的模板DNA或者RNA進行測序,實現(xiàn)真正意義上的實時測序[36].張晨陽等[37]應(yīng)用高通量二代測序技術(shù)對小鼠腸內(nèi)容物菌群16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進行擴增,探究番瀉葉灌胃對小鼠腸內(nèi)容物菌群的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)番瀉葉灌胃后可改變小鼠腸內(nèi)容物菌群中Streptococcus,Sutterella和Dorea的變化.之后又利用高通量三代測序技術(shù)獲取小鼠腸黏膜16S rRNA基因全長序列信息,分析小鼠腸黏膜微生物對肝氣乘脾證泄瀉的影響發(fā)現(xiàn)[38],模型組小鼠腸黏膜菌群多樣性與空白組相比明顯升高.其中Stigmatella aurantiaca、Candidatus arthromitus sp.SFB-mouse、Erythrobacter gaetbuli、Desulftobacterium hafniense、Ochrobactrum pituitosum和Candidatus arthromitus sp.SFB-mouse-NL明顯降低,提示肝氣乘脾證泄瀉的發(fā)生與腸黏膜菌群多樣性、群落結(jié)構(gòu)以及相對豐度相關(guān).雖然測序技術(shù)在短短幾十年的時間里取得了突飛猛進的發(fā)展,但仍存在亟待完善的地方,二代測序在大基因檢測時,其測序讀長較短會產(chǎn)生大量高度碎片化的重復(fù)片段,對于后續(xù)測序拼接成為較大困擾;同時在測序讀長時針對某一可變區(qū)域進行,讀長長度較短;并且測序時間長,無法完全滿足臨床樣本快速診斷的需要[39].而三代測序平臺讀長較長,測序錯誤率較高,后續(xù)數(shù)據(jù)處理分析較依賴處理軟件與數(shù)據(jù)庫的選擇[40].基于HTS的宏基因組學(xué)技術(shù)通過提取腸道中的微生物總DNA、構(gòu)建文庫,可獲得大量腸道微生物群落種類、豐度及相關(guān)生物學(xué)信息,為人類研究腸道營養(yǎng)健康提供支持[41].郭抗蕭等[42]基于宏基因組技術(shù)評估七味白術(shù)散對腸道菌群失調(diào)腹瀉的治療機理發(fā)現(xiàn),經(jīng)七味白術(shù)散治療后小鼠腸道菌群菌屬結(jié)構(gòu)以及多樣性等發(fā)生明顯改變,說明七味白術(shù)散可能對菌群失調(diào)腹瀉小鼠腸道細菌群落有恢復(fù)的作用.

HTS技術(shù)不僅能夠反映環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu),而且在以功能基因為核心的分子生態(tài)學(xué)研究也備受青睞[43].mcrA基因編碼mcr的A亞基,可作為腸道甲烷產(chǎn)量的生物標(biāo)記物檢測產(chǎn)甲烷菌的多樣性和系統(tǒng)發(fā)育情況,對于研究針對性減少甲烷的方法具有積極作用[44].硫酸鹽還原細菌(sulphate-reducing bacteria,SRB)的功能基因dsrB可鑒定SRB物種信息來探究炎癥性腸病與SRB之間的可能聯(lián)系,為之后中醫(yī)藥治療提供指導(dǎo)性建議[45].賀璐等[46]探討四磨湯對脾虛便秘小鼠腸道細菌功能基因的影響時,發(fā)現(xiàn)四磨湯可通過提高腸道細菌能量和營養(yǎng)物質(zhì)的代謝,提高遺傳信息的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和跨膜轉(zhuǎn)運水平來達到治療脾虛便秘的效果.微生物的各種轉(zhuǎn)化功能主要依賴酶來完成,通過編碼相關(guān)酶的功能基因作為微生物功能標(biāo)記物,成為了微生物多樣性研究的新方向[47].在探究七味白術(shù)散對菌群失調(diào)腹瀉小鼠腸道黏膜細菌乳糖酶基因多樣性的影響時,龍承星[48]發(fā)現(xiàn)七味白術(shù)散對小鼠腸道黏膜細菌乳糖酶基因的多樣性和豐度有明顯恢復(fù)作用,能夠修復(fù)小鼠腸道黏膜細菌產(chǎn)乳酶基因的群落結(jié)構(gòu).實驗試從腸道黏膜細菌乳糖酶基因多樣性層面進一步探討七味白術(shù)散對菌群失調(diào)腹瀉療效的認(rèn)識,為闡明七味白術(shù)散對菌群失調(diào)腹瀉療效的現(xiàn)代生物學(xué)機理提供佐證.由此可以看出,中醫(yī)藥發(fā)揮療效時可通過借助高通量測序技術(shù)從腸道菌群中的物種組成分析、多樣性分析、物種差異分析、功能基因等方面準(zhǔn)確獲取腸道微生物信息,揭示多種腸道疾病相關(guān)的分子機制,為之后進一步挖掘中醫(yī)藥作用的具體作用靶點(如針對某一通路或功能預(yù)測)埋下伏筆,也為更好探究中醫(yī)藥與腸道微生物的關(guān)系提供研究基礎(chǔ).

2.2 基于蛋白質(zhì)的分析技術(shù) 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)日趨成熟,蛋白質(zhì)組學(xué)在促進中醫(yī)藥腸道微生態(tài)領(lǐng)域發(fā)展的同時,中醫(yī)藥研究也為蛋白質(zhì)組學(xué)提供方向與動力,已成為蛋白質(zhì)組學(xué)的重要研究領(lǐng)域之一[49].王佳等[50]探討健脾祛痰化瘀法對脾虛痰濁動脈粥樣硬化巴馬豬小腸差異蛋白的影響時發(fā)現(xiàn),健脾祛痰化瘀中藥方影響脾虛痰濁動脈粥樣硬化巴馬豬小腸多種蛋白表達,涉及細胞黏附分子、脂肪消化和吸收、膽汁酸分泌等通路,提示該方通過調(diào)控這些關(guān)鍵通路蛋白的表達改善巴馬豬小腸消化吸收功能異常,進而改善脾虛痰濁動脈粥樣硬化.蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展為我們深入研究疾病過程中蛋白質(zhì)表達和功能作用提供了可能.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以在整體水平上檢測出疾病中一些特異蛋白的表達,明確疾病過程中相關(guān)蛋白的表達和功能變化,加快對疾病病理改變的認(rèn)識.將中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究與蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)合,從微觀角度探討中藥復(fù)方作用機制,為中醫(yī)藥的證候治療提供準(zhǔn)確分子標(biāo)志物,以此針對性的達到治療的效果.

2.3 基于代謝產(chǎn)物的分析技術(shù) 腸道細菌代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)在機體生理和病理過程中扮演著重要角色.隨著關(guān)于SCFAs在機體中的作用研究的不斷深入,越來越多的實驗要求對人或?qū)嶒瀯游锛S便或腸內(nèi)容物種中短鏈脂肪酸含量進行方便、快捷的測定[51].目前的檢測方法以色譜技術(shù)較為常見.在探究肺系調(diào)治方治療小兒反復(fù)呼吸道感染的實驗中,吳月瀅[52]發(fā)現(xiàn)肺系調(diào)治方可促進大鼠腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、正丁酸的表達,提示肺系調(diào)治方治療小兒反復(fù)呼吸道感染的作用機制可能與大鼠腸內(nèi)容物中增加的SCFAs有關(guān).李慧等[53]探討黃連解毒湯對小鼠糞便中SCFAs代謝的影響時發(fā)現(xiàn),灌胃黃連解毒湯后小鼠糞便中乙酸、丙酸和丁酸含量顯著升高,提示黃連解毒湯可能促進了腸道菌群代謝,從而導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸增加.通過應(yīng)用色譜技術(shù)檢測SCFAs的含量變化可以間接的反映出機體腸道細菌的變化,有利于挖掘腸道中產(chǎn)乙酸、丙酸、丁酸的腸道有益細菌,是中醫(yī)藥通過促進這些有益細菌生長及靶向調(diào)控防治多種人體疾病的潛在重要方法,以此為中醫(yī)藥防治疾病及藥物研發(fā)提供新的研究思路.

3 腸道酶活性檢測技術(shù)在中醫(yī)藥調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)研究中的應(yīng)用

酶能在溫和的條件下,高效率促進生物體的新陳代謝.腸道功能酶是機體腸道內(nèi)重要組成部分,影響機體營養(yǎng)物質(zhì)吸收、免疫以及生長發(fā)育[54].酶活性檢測技術(shù)已逐漸應(yīng)用于腸道內(nèi)容物以及腸黏膜各種功能酶活性的檢測中.吳儀等[55]用痛瀉要方治療肝氣乘脾泄瀉小鼠,應(yīng)用酶活性檢測小鼠腸黏膜前、中、后段及腸內(nèi)容物中消化酶活性發(fā)現(xiàn),與自然恢復(fù)組比,中藥干預(yù)組小鼠腸內(nèi)容物中乳糖酶活性升高,腸道前段黏膜纖維素酶活性顯著降低,腸道中段黏膜蛋白酶、淀粉酶以及纖維素酶活性升高,腸道后段黏膜乳糖酶、蔗糖酶活性顯著升高,提示痛瀉要方對肝氣乘脾泄瀉小鼠腸道消化酶活性具有調(diào)節(jié)作用,但對于腸道不同部位消化酶活性調(diào)節(jié)作用有所不同.譚周進等[56]發(fā)現(xiàn)七味白術(shù)散對菌群紊亂腹瀉的腸道微生態(tài)環(huán)境具有調(diào)整作用,之后在探究七味白術(shù)散對抗生素所致腹瀉小鼠腸道乳糖酶活性的影響時發(fā)現(xiàn),七味白術(shù)散治療后小鼠腸道黏膜乳糖酶活性恢復(fù)且提高,說明七味白術(shù)散可促進腹瀉小鼠腸道黏膜乳糖酶活性恢復(fù)而治療腹瀉[16].基于此,通過檢測腸道中各種消化酶活性發(fā)現(xiàn),中藥不僅可以通過腸道黏膜影響腸道消化酶的分泌量,使腸道消化酶活性發(fā)生變化,而且還會影響腸道微生物使腸道酶的來源受到影響,進一步闡明中藥對腸道消化酶活性的調(diào)節(jié)機理,為之后從酶活性角度探索中藥調(diào)節(jié)腸道菌群治療疾病提供思考.

4 腸道微生物活度檢測技術(shù)在中醫(yī)藥調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)研究中的應(yīng)用

微生物活度檢測技術(shù)最早應(yīng)用于土壤微生物檢測當(dāng)中,腸道中不同種類的酶能夠反映微生物參與生化反應(yīng)的活躍程度,也是微生物活度檢測的重要指標(biāo)[57].熒光素二乙酸(fluorescein diacetate,FDA)能夠被細菌及真菌中的非專一性酶水解,我們常通過測定樣品FDA水解程度體現(xiàn)腸道中微生物的總體活度[58].惠華英等[17]在研究葛根芩連湯對腸道濕熱證泄瀉小鼠腸內(nèi)容物及腸黏膜微生物活度影響時發(fā)現(xiàn),治療組小鼠腸內(nèi)容物及黏膜微生物活度降低向正常組水平變化,提示葛根芩連湯治療腸道濕熱證泄瀉可能與腸道微生物活度有關(guān).腸道微生物活度可在一定程度上反映腸道微生物的總體代謝能力,腸內(nèi)容物以及腸黏膜中微生物活度的不同提示處于此處的腸道微生物的種類、豐度等有所差異,不同種類、豐度的腸道微生物必然會影響微生物總體代謝能力.通過腸道微生物活度檢測可明確中藥治療疾病過程中對于腸道微生物總體代謝能力的調(diào)控作用,豐富了中醫(yī)藥治療與腸道微生物的關(guān)系,也為今后從腸道微生態(tài)出發(fā)探討中醫(yī)藥治療臨床疾病的機理打開一扇新的大門.

5 其他檢測技術(shù)在中醫(yī)藥調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)研究中的應(yīng)用

體外模擬胃腸系統(tǒng)是一種基于生理學(xué)模擬生物體進行生物學(xué)研究的創(chuàng)新技術(shù).針對腸道益生菌的開發(fā)與應(yīng)用,胃腸道環(huán)境耐受性試驗已成為一個主要內(nèi)容.我們通常采用體外模擬胃腸道環(huán)境模型對其進行評價,為更好的評估益生菌的適應(yīng)性及其科學(xué)有效的使用提供依據(jù).劉艷平等[59]在探究知母皂苷BⅡ模擬人體胃腸道環(huán)境的穩(wěn)定性研究時,發(fā)現(xiàn)知母皂苷BⅡ在人工胃液、人工腸液中能穩(wěn)定生存,不會發(fā)生明顯降解,這對于知母皂苷BⅡ劑型選擇和生物利用度改善具有重要意義,也為進一步闡明知母的體內(nèi)藥效物質(zhì)提供參考.

6 結(jié)論

腸道微生物的平衡與宿主的健康和疾病有著密切的關(guān)聯(lián).中醫(yī)藥通過調(diào)控腸道微生物中菌種結(jié)構(gòu)組成,從而維持腸道微生態(tài)平衡,對疾病的治療有顯著效果.目前,分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛運用于中醫(yī)藥調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)研究中,通過分子生物學(xué)技術(shù)來探討腸道微生態(tài)的平衡與紊亂,闡釋腸道微生物與宿主的生理及病理相關(guān)性,揭示多種腸內(nèi)外疾病中醫(yī)癥候表現(xiàn)的分子機制,為中醫(yī)藥治療腸道微生態(tài)相關(guān)疾病提供理論依據(jù)和研究基礎(chǔ),這對于全面了解中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)腸道菌群方面取得新的突破性進展,推動中藥現(xiàn)代化研究進程具有重要的意義.相較于傳統(tǒng)的腸道微生物研究方法,目前的技術(shù)手段已經(jīng)取得了非常大的進步.但是這些技術(shù)仍然存在缺陷,對于研究腸道微生物來說仍顯不足,如對于樣品的處理方式應(yīng)有所突破,樣品信息的處理仍需優(yōu)化.在未來,隨著分子生物學(xué)自身的發(fā)展,期待有更簡便快捷的方法出現(xiàn),并結(jié)合目前已有的研究技術(shù),按照需求進行選取以更有效地達到實驗?zāi)康?而借助生物大數(shù)據(jù)的方法可能會是未來研究的發(fā)展方向.