葉淑芳,張劍美,代 飛,藍(lán)陳菊,章小君,周麗珍,湯清清,孟 飛

葉淑芳,張劍美,代飛,藍(lán)陳菊,章小君,周麗珍,麗水市人民醫(yī)院消化內(nèi)科,浙江省麗水市 323000

湯清清,孟飛,杭州致遠(yuǎn)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司,浙江省杭州市 310000

0 引言

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染存在于50%以上的世界人口,并已證實(shí)它與慢性胃炎、消化性潰瘍等多種上消化道疾病相關(guān)[1].克拉霉素和左氧氟沙星是H.pylori根除治療的常用藥物,但是隨著抗生素的廣泛使用,克拉霉素及左氧氟沙星等的耐藥率越來(lái)越高,抗生素耐藥成為H.pylori感染患者根除失敗的主要原因[2].

H.pylori對(duì)克拉霉素耐藥已經(jīng)證實(shí)與23S rRNA的結(jié)構(gòu)域V區(qū)肽基轉(zhuǎn)移酶中的點(diǎn)突變相關(guān)[3],最常見的突變是位置A2142G和A2143G.H.pylori對(duì)喹諾酮耐藥主要是由于gyrA喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)基因發(fā)生突變,gyrA基因主要有下列兩種突變(Asn87,Asp91)[4].此外,目前有不少研究報(bào)道外排泵基因過(guò)表達(dá)可以增加菌株的耐藥性的[5,6].在腸桿菌科細(xì)菌中,最常見的外排泵為耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化家族(resistance nodulation cell division family,RND),而該家族中研究較深入的就是AcrAB-外膜蛋白(outer membrane proteins,OMP)ToIC參與的外排泵系統(tǒng).ToIC可以與許多內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合,參與幾乎所有的抗生素外排過(guò)程,因此對(duì)細(xì)菌的耐藥性及臨床治療都有重要影響[7,8].

與常規(guī)方法相比,二代測(cè)序可提供有關(guān)細(xì)菌基因組信息的深入信息.這些技術(shù)全面追蹤抗生素耐藥性菌株的基因組信息,能促進(jìn)臨床對(duì)感染患者進(jìn)行特異性和合理治療.

在本研究中,我們首先通過(guò)呼氣試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)篩選出10例H.pylori菌株,包括5例雙重耐藥菌株和5例全敏感菌株,用PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證并進(jìn)行全基因組測(cè)序.我們著眼于雙重耐藥外排泵的變異,這些變異對(duì)內(nèi)在和獲得性抗生素耐藥性都有貢獻(xiàn),闡明耐藥新機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本收集:選取因胃部疾病至麗水市人民醫(yī)院就診的胃鏡檢查患者,于胃鏡下采集胃黏膜標(biāo)本一份,置于組織保存管中,低溫運(yùn)輸送檢.該研究已通過(guò)麗水市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核.所有患者均同意在本研究中使用其樣品,并簽署了知情同意書.

1.1.2 病例入選標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡18-70歲,男女不限;(2)呼氣試驗(yàn)結(jié)果為H.pylori陽(yáng)性;(3)近2 wk內(nèi)未使用抗生素、鉍劑、H2受體拮抗劑或PPI制劑.病例排除標(biāo)準(zhǔn):(1)嚴(yán)重心、肝、腎功能損害者;(2)妊娠或哺乳期婦女;(3)有食管、胃腸手術(shù)史者;(4)患者不能正確表達(dá)自己的主訴,如精神病、嚴(yán)重神經(jīng)官能癥者;(5)患者同時(shí)服用非甾體抗炎藥或酗酒.

1.2 方法

1.2.1H.pylori培養(yǎng)及藥敏:胃粘膜標(biāo)本經(jīng)過(guò)研磨后接種于含5%羊血的哥倫比亞培養(yǎng)基,37 ℃微需氧培養(yǎng)(5%O2、10% CO2、85% N2)2-3 d,觀察菌落的生長(zhǎng)情況,經(jīng)生化反應(yīng)(尿素酶、氧化酶、過(guò)氧化氫酶)試驗(yàn)和鏡檢鑒定,確定為H.pylori菌株后保存菌株.

采用瓊脂稀釋法進(jìn)行藥敏檢測(cè):將生長(zhǎng)出的H.pylori菌株分別收集于生理鹽水中,配制成吸光度2-3麥?zhǔn)系木鷳乙?滴加于抗生素平板上,每滴2-3 μL,每個(gè)平板滴數(shù)在15-25滴之間.建立平行一組,空白對(duì)照一組.于37 ℃微需氧培養(yǎng)(5% O2、10% CO2、85% N2)的條件下培養(yǎng)2-3 d,判讀藥敏結(jié)果,若有H.pylori菌株生長(zhǎng)則為耐藥,無(wú)H.pylori菌株生長(zhǎng)為敏感.其中克拉霉素及左氧氟沙星的耐藥臨界值分別為1 μg/mL和2 μg/mL.質(zhì)控菌株為H.pyloriATCC26695.

1.2.223S rRNA及gyrA基因突變的特異性PCR:PCR體系包含2×Mix(杭州擎科生物技術(shù)有限公司)15 μL,5×Enhancer buffer 6 μL,dd H2O 5 μL,引物Forward和Reverse各1 μL和2 μL DNA模板.引物序列如下:23S rRNAForward:ATGAATGGCGTAACGAGATG;23S rRNAReverse:ACACTCAACTTGCGATTTCC;gyrAForward:GATCATAGGGCGCGCTTTACC;gyrAReverse:AAGTCGCCATCCCTACAGCGA.PCR條件如下:94 ℃2 min;94 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s和72 ℃ 10 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃5 min.PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳確定大小.

1.2.3 基因組DNA提取和全基因組的制備:用Qiagen細(xì)菌基因組提取試劑盒提取H.pylori基因組DNA.用Qubit檢測(cè)試劑盒(Invitrogen公司,美國(guó))測(cè)量每個(gè)樣品的DNA濃度.通過(guò)使用Nextera XT DNA樣品制備試劑盒(Illumina公司,美國(guó))進(jìn)行H.pylori菌株文庫(kù)的構(gòu)建.根據(jù)試劑盒說(shuō)明書將DNA均勻剪切成500 bp左右的片段,并加上接頭序列構(gòu)成DNA文庫(kù),然后在Illumina MiSeq測(cè)序儀上運(yùn)行.使用MiSeq控制軟件分析熒光圖像,并使用MiSeq Reporter Analysis創(chuàng)建FASTQ格式的序列數(shù)據(jù).

1.2.4 序列讀取和單核苷酸變體(single nucleotide variants,SNV)檢測(cè):重測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)處理后獲得原始數(shù)據(jù),為了降低突變的錯(cuò)誤率,過(guò)濾掉起始的10個(gè)堿基,并截?cái)嗔嗣總€(gè)>Q20讀數(shù)的末端30個(gè)堿基,然后利用BWA[2](version 0.7.12)比對(duì)軟件,將clean data比對(duì)到參考基因組序列上,統(tǒng)計(jì)比對(duì)結(jié)果,包括比對(duì)參考序列reads數(shù),平均深度及覆蓋率等.參考基因組選用ATCC26695.通過(guò)比對(duì)結(jié)果,去除出每個(gè)文庫(kù)中由于PCR擴(kuò)增引起的重復(fù)序列,然后使用SAMTOOLS(version 1.1)軟件進(jìn)行SNV/InDel鑒定,通過(guò)SAMTOOLS的Mpileup模塊和Bcftools分析每個(gè)位點(diǎn)具體的測(cè)序信息等.

1.2.5 臨床H.pylori菌株中的雙重耐藥外排泵的變異:為了鑒定這些臨床分離菌株中的其他可能變異,我們接下來(lái)檢查了與TolC同源物的四個(gè)基因簇的遺傳變異.將不同來(lái)源的H.pylori耐藥基因與參考菌株26695(GenBank登錄號(hào):NZ CP010436)進(jìn)行比對(duì),并結(jié)合耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分析耐藥機(jī)制間的關(guān)系.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理通過(guò)獨(dú)立t檢驗(yàn)分析了外排泵基因的遺傳變異與耐藥性表型之間的關(guān)聯(lián).使用95%置信區(qū)間,P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.所有統(tǒng)計(jì)分析軟件采用SPSS 24.0.

2 結(jié)果

2.1 患者收集情況 2014-06至2015-06,共入選患者60名,入選患者年齡在18-70歲之間,平均年齡為46.93歲,男女比例為1.4:1.男女間年齡不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2.2H.pylori培養(yǎng)及藥敏結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)共分離獲得H.pylori菌株51例.藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1.其中克拉霉素和左氧氟沙星都耐藥的有5例,克拉霉素與左氧氟沙星都敏感的有13例.克拉霉素耐藥率達(dá)到43.1%,左氧氟沙星耐藥率達(dá)到41.2%.

2.3 PCR分析結(jié)果 選取對(duì)克拉霉素及左氧氟沙星都耐藥的H.pylori菌株5例及對(duì)克拉霉素及左氧氟沙星均敏感的菌株5例進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增.

兩種不同抗性的菌株測(cè)序結(jié)果如圖1所示.在對(duì)兩種抗生素都耐藥的菌株中23S rRNA基因中2143位均具有A>G變異,gyrA基因中有4例在87位變異,1例在91位變異.而在5個(gè)克拉霉素及左氧氟沙星敏感株的23S rRNA及gyrA基因的相同位置上沒有有義變異.因此,PCR結(jié)果與藥敏結(jié)果一致.

2.4 外排泵基因中編碼序列(coding sequence,CDS)變異分析 臨床分離株中外排泵基因CDS變異數(shù)見表2.對(duì)TolC同源物的四個(gè)基因簇SNV與臨床分離株耐藥性相關(guān)性分析,沒有發(fā)現(xiàn)外排泵中SNV總數(shù)與敏感和耐藥菌株之間存在顯著差異.

我們對(duì)外排泵編碼基因簇中的SNV進(jìn)行了更詳細(xì)的分析,在雙重耐藥性H.pylori菌株中發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變的SNV.在5株克拉霉素及左氧氟沙星耐藥的菌株中,HP0970中存在C111T突變而在5株敏感菌株中未發(fā)現(xiàn)該突變.沒有發(fā)現(xiàn)敏感菌株中突變而雙重耐藥菌株中不突變的位點(diǎn).這些結(jié)果表明外排泵基因中的突變SNV可能有助于菌株對(duì)抗生素的耐藥性分布.

3 討論

目前H.pylori感染的治療方法主要基于質(zhì)子泵抑制劑與阿莫西林和克拉霉素等抗生素聯(lián)用[9],但標(biāo)準(zhǔn)的三聯(lián)療法的治愈率已逐漸降低到不可接受的水平[10].共識(shí)指出[11],當(dāng)克拉霉耐藥率高于15%-20%時(shí),不應(yīng)使用三聯(lián)療法來(lái)治療H.pylori感染,應(yīng)考慮其他治療方案.克拉霉素及左氧氟沙星是根除H.pylori感染的常用藥物,然而這兩種藥物的廣泛使用導(dǎo)致H.pylori原發(fā)性耐藥的增加.一項(xiàng)研究表明,H.pylori對(duì)常用抗生素的三重耐藥率達(dá)到了7.8%[12].

本研究藥敏試驗(yàn)表明,麗水地區(qū)克拉霉素及左氧氟沙星的耐藥率都達(dá)到了40%以上,高于浙江省地區(qū)的平均水平(克拉霉素16.1%,左氧氟沙星19.5%)[13].說(shuō)明近些年這兩種抗生素在麗水地區(qū)一直在廣泛使用,應(yīng)高度重視抗生素的應(yīng)用,防止濫用.

H.pylori菌株中23S rRNA基因及gyrA基因位點(diǎn)突變與菌株對(duì)克拉霉素及左氧氟沙星產(chǎn)生耐藥是目前的已知機(jī)制,此外,H.pylori對(duì)抗生素耐藥性似乎與其他因素有關(guān),例如對(duì)克拉霉素產(chǎn)生耐藥性還與菌株rRNA甲基化酶的產(chǎn)生[14],大環(huán)內(nèi)酯滅活酶的作用以及主動(dòng)外排泵基因突變有關(guān)[15],這些在多種細(xì)菌中都有描述,但缺乏其他遺傳機(jī)制的證據(jù).還有一些研究表明,其他細(xì)菌遺傳因素也可能導(dǎo)致耐藥性增加[16].但是,尚無(wú)有關(guān)H.pylori其他細(xì)菌因素的遺傳證據(jù).

表 1 H.pylori 臨床分離菌株藥敏結(jié)果

應(yīng)用PCR方法檢測(cè)H.pylori23S rRNA及gyrA基因中的突變,確認(rèn)了這些突變結(jié)果與藥敏結(jié)果相同.PCR利用特異性引物測(cè)定突變基因的方法已經(jīng)比較完善,可以明確鑒定H.pylori菌株對(duì)克拉霉素或左氧氟沙星相關(guān)耐藥基因的突變.PCR是用于鑒定一個(gè)堿基對(duì)基因變異的有效方法,但全基因組測(cè)序可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)堿基對(duì)變異.我們通過(guò)基于大規(guī)模Illumina的平臺(tái)對(duì)H.pylori分離株的整個(gè)基因組進(jìn)行全基因組重測(cè)序.測(cè)序結(jié)果可以清楚地區(qū)分H.pylori基因組中的23S rRNA及gyrA基因中的點(diǎn)突變.為了未來(lái)的H.pylori感染治療有更多方法,我們需要知道雙重耐藥菌株外排泵基因的變異是否是菌株耐藥性產(chǎn)生的內(nèi)在因素.RND家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是微生物外排系統(tǒng)中的重要組成部分.RND類外排泵是革蘭氏陰性菌產(chǎn)生多重耐藥的重要原因[17].在H.pylori26695基因組中,存在編碼RND類外排泵的基因,包括TolC同源物的四個(gè)基因簇HP0605-HP0607(hefABC),HP0971-HP0969(hefDEF),HP1327-HP1329(hefGHI)和HP1489-HP1487[18].本研究發(fā)現(xiàn)在雙重耐藥菌株中的H.pylori外排泵系統(tǒng)的四個(gè)基因簇(HP0605-HP0607,HP0971-HP0969,HP1327-HP1329和HP1489-HP1487)中存在一個(gè)位點(diǎn)突變,而敏感菌株中沒有.這表明外排泵基因可能有助于微生物耐藥性的產(chǎn)生,這與其他研究結(jié)果類似.

本研究探索了雙重耐藥H.pylori的外排泵的重要性.外排泵基因的特定變異與克拉霉素和左氧氟沙星耐藥表型之間存在聯(lián)系[5,6].這些基因突變的確切機(jī)制尚不清楚.內(nèi)在耐藥性的可能機(jī)制包括減少藥物吸收或增加藥物外排.本研究結(jié)果表明外排泵基因的變異可能與臨床分離物中的藥物敏感性相關(guān),藥物耐藥的相關(guān)基因突變可能引導(dǎo)外排泵基因同時(shí)突變.全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)包括目前無(wú)法從小規(guī)模分析中獲得的大量其他信息.

表 2 臨床分離株中外排泵基因編碼序列變異數(shù)

圖 1 耐藥基因突變位點(diǎn)分析.

4 結(jié)論

我們通過(guò)PCR的方法驗(yàn)證了H.pylori耐藥性的基因型,并揭示了全基因組測(cè)序在H.pylori耐藥分析中的潛力.研究結(jié)果表明了克拉霉素及左氧氟沙星耐藥性菌株中外排泵基因變異的重要作用.由于我們?nèi)虢M患者數(shù)據(jù)量較小,結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證.因此可以使用全基因組方法進(jìn)行進(jìn)一步分析大數(shù)據(jù)的雙重耐藥H.pylori臨床分離菌株以獲得更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

目前抗生素耐藥已經(jīng)成為幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染患者根除失敗的主要原因.外排泵基因與抗生素耐藥存在一定的關(guān)聯(lián)性,先前的不少研究已證實(shí)外排泵基因過(guò)表達(dá)可以增加菌株的耐藥性的.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

外排泵基因的研究可以解決當(dāng)前H.pylori耐藥基因研究不足的缺點(diǎn),研究結(jié)果對(duì)未來(lái)幽門螺桿菌耐藥機(jī)制起到一定的數(shù)據(jù)支持作用.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本實(shí)驗(yàn)將找出雙重耐藥菌株與敏感菌株外排泵基因存在的變異,探索外排泵基因的變異與雙重耐藥菌株耐藥性產(chǎn)生的內(nèi)在聯(lián)系.

實(shí)驗(yàn)方法

用13C呼氣試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)篩選出雙重耐藥菌株及敏感菌株,用特異性PCR的常規(guī)方法進(jìn)行耐藥基因突變位點(diǎn)的驗(yàn)證,基于MiSeq平臺(tái),分別對(duì)雙重耐藥菌株及敏感菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序,以鑒定雙重耐藥表型與敏感表型的外排泵基因的單核苷酸變體(SNV)并進(jìn)行分析.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

篩選出雙重耐藥菌株5株,特異性PCR耐藥基因突變位點(diǎn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)5株臨床雙重耐藥菌株中檢測(cè)到23S rRNA基因及gyrA的點(diǎn)突變,而在5株臨床敏感菌株中未檢測(cè)到.在5株克拉霉素及左氧氟沙星耐藥的菌株中,HP0970中存在C111T突變而在5株敏感菌株中未發(fā)現(xiàn)該突變.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)在雙重耐藥菌株中的H.pylori外排泵系統(tǒng)的四個(gè)基因簇中存在一個(gè)C111T位點(diǎn)突變,而敏感菌株中沒有.這表明外排泵基因可能有助于微生物耐藥性的產(chǎn)生.

展望前景

利用全基因組測(cè)序?qū).pylori外排泵基因進(jìn)行研究,揭示了全基因組測(cè)序在H.pylori耐藥分析中的潛力,對(duì)于H.pylori基因型與表型的關(guān)系有了新的認(rèn)識(shí),對(duì)未來(lái)關(guān)于H.pylori耐藥機(jī)制的研究起到一定的數(shù)據(jù)支持作用.