傅子鵬，劉成斌，李秋菊，毛 舜

(同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院/ 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海 200092)

人體糞便中含有眾多微生物，其中病原微生物包括志賀氏菌(Shigellaspp.)、沙門氏菌(Salmonellaspp.)、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、諾如病毒(Norwalk virus)等。這些病原體通過污染食物或水源感染人類，引發(fā)腹瀉、腸胃炎、敗血癥等疾病，發(fā)病率高[1]。另外，糞便中的腸道微生物組與人體健康直接相關(guān)，影響著從代謝疾病到胃腸道疾病和結(jié)腸直腸癌等慢性疾病的發(fā)展[2]。不衛(wèi)生的如廁條件、糞便等污染物的不安全排放導(dǎo)致全球每年約150萬兒童感染疾病，是非洲地區(qū)引起兒童死亡的主要因素[3]。國內(nèi)很多農(nóng)村地區(qū)廁所環(huán)境不佳，雨天污染物容易溢出致使病原菌擴(kuò)散；同時，廁所生物污染物容易傳播疾病，增加人群發(fā)病率[4]。近年來，隨著國家和社會對農(nóng)村廁所環(huán)境的愈發(fā)關(guān)注，國家大力推動“廁所革命”，將農(nóng)村廁所改造成無害化衛(wèi)生廁所[5]。在改廁的過程中仍然存在糞便污染物的分布及風(fēng)險不明、資源化轉(zhuǎn)化過程(如堆肥)中污染物遷移轉(zhuǎn)化機(jī)理不清的問題。因此，對糞便中的病原微生物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測對推動農(nóng)村廁所環(huán)境改善和廁所糞便的資源化利用具有重要的意義。

針對糞便中病原微生物的檢測，傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測法一般使用紙片、紙膜、膠片等作為培養(yǎng)基載體，將特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)附著在上面，通過微生物的生長、顯色來進(jìn)行測定。以糞便中的沙門氏菌檢測為例，首先對糞便進(jìn)行采樣制備，在適宜條件下培養(yǎng)增菌，之后進(jìn)行分離觀察鑒定[6]。培養(yǎng)檢測法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是全世界用于檢測微生物的基本工具；但其缺點在于需要專業(yè)人員操作，對實驗材料有特定要求，檢測耗時長，通常需要5～7 d[7]。因此，培養(yǎng)檢測法往往不能滿足快速檢測的需要。

近年來，糞便中病原微生物的快速檢測方法受到環(huán)境分析領(lǐng)域的關(guān)注。根據(jù)檢測原理，病原微生物的快速檢測方法可分為基于核酸的檢測方法、基于免疫學(xué)的檢測方法和基于生物傳感器的檢測方法。基于核酸的檢測方法通常對目標(biāo)序列進(jìn)行放大擴(kuò)增，可以檢測目標(biāo)病原體的特定基因，檢測準(zhǔn)確度高；基于免疫學(xué)的檢測方法利用抗原-抗體雜交反應(yīng)，據(jù)此開發(fā)的試劑盒能夠快速簡便地檢測目標(biāo)物；基于生物傳感器的檢測方法主要依靠光學(xué)原理和電化學(xué)原理，樣品制備簡單，能夠?qū)崿F(xiàn)檢測系統(tǒng)的微型化、模塊化和集成化。

1 糞便樣品的前處理

糞便樣品中除了腸道細(xì)菌外，還有腐殖質(zhì)、腸道內(nèi)壁脫落細(xì)胞及碎片、各種有機(jī)物和無機(jī)物等[8]。糞便樣品作為一種生物樣品，成分復(fù)雜多樣，在分析之前需要進(jìn)行前處理，去除干擾物，使待測物純度達(dá)到儀器要求[9]。糞便樣品的前處理目前缺乏標(biāo)準(zhǔn)化程序[10]，通常取樣后在低溫環(huán)境下保存樣品，經(jīng)過離心、破碎、稀釋等步驟后，依據(jù)商用試劑說明書進(jìn)行DNA提取操作和后續(xù)分析。較為常用的商用DNA提取試劑盒處理方法有E.Z.N.A Bacterial DNA Kit法、E.Z.N.A Mag-Bind Soil DNA Kit法、FastDNA Spin Kit for Soil法、QIAamp DNA Stool Mini Kit法、QIAamp Powerfecal DNA Kit法、TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒法和Wizard?Genomic DNA Purification Kit法等[11]。BECKMAN等[12]檢測糞便中的幽門螺桿菌時，首先將糞便樣品于-20 ℃條件下冷凍保存，之后使用QIAamp快速糞便試劑盒提取DNA進(jìn)行后續(xù)檢測。ZHANG等[13]使用TIANGEN公司生產(chǎn)的TIANamp stool DNA試劑盒從46個臨床樣品中提取DNA，然后利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)進(jìn)行分析，成功檢出糞便樣品中的志賀氏菌。ZHAO等[14]開發(fā)了一種通過聲流處理糞便樣品的微流控芯片，借助聲換能器件產(chǎn)生的渦流將糞便樣品緩沖液以高達(dá)30 μL·min-1的流速進(jìn)行均質(zhì)化，并過濾掉碎屑，通過100 mm寬的微柱陣列進(jìn)一步純化糞便樣品(圖1)。通過該方法制備的糞便樣品能夠保證細(xì)菌具備一定的形態(tài)完整性和生存力，便于后續(xù)檢測。

2 基于核酸的快速檢測方法

核酸檢測在疾病診斷、基因表達(dá)和生物鑒定等領(lǐng)域應(yīng)用較廣。由于核酸通常是痕量的，基于核酸的檢測方法一般需要通過有效地放大目標(biāo)序列來擴(kuò)增其含量，即核酸擴(kuò)增技術(shù)。核酸擴(kuò)增技術(shù)根據(jù)操作時溫度的差別可大致分為2類：熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)和等溫擴(kuò)增技術(shù)[15]。在熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)方面，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是用于檢測微生物最為常用和成熟的技術(shù)，該方法可用于分離，擴(kuò)增和定量短DNA序列。

在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上拓展出一些其他的擴(kuò)增方法，如實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)，該方法通過熒光標(biāo)記的探針能夠在擴(kuò)增過程中檢測靶標(biāo)PCR，結(jié)合光學(xué)傳感器使其具有更高的靈敏度，比常規(guī)的PCR更容易進(jìn)行定量檢測。BECKMAN等[12]評估了使用糞便標(biāo)本檢測幽門螺桿菌的可能性，使用qPCR檢測294個糞便標(biāo)本，227個樣本為陽性，表明在人類糞便樣本中可以檢測到幽門螺桿菌，因此無需進(jìn)行胃活檢就可以確定該細(xì)菌的存在。逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)可以區(qū)分活細(xì)胞和非活細(xì)胞，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)PCR無法檢測活細(xì)胞的缺點，并且可以檢測處于生長期的細(xì)菌。巢式PCR(nested PCR)能夠在提取RNA后借助DNA庫對多個樣品同時進(jìn)行測序，大大加快了病毒的測序速度，被用于檢測糞便中的脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)[16]。作為熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，以上的方法需要昂貴的測試平臺，并且需要設(shè)計合適的引物，且過程繁瑣耗時，不適合在缺乏相關(guān)設(shè)備的地區(qū)對糞便中病原微生物進(jìn)行快速檢測。

等溫擴(kuò)增技術(shù)省去了熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)中的變性、退火步驟，無需特殊的控溫設(shè)備即可實現(xiàn)靶序列循環(huán)擴(kuò)增，大大縮短了檢測時間，能夠方便地用于病原微生物的高效檢測。其中較為成熟的技術(shù)是LAMP技術(shù)。該技術(shù)基于鏈置換原理[17]，通過DNA聚合酶催化進(jìn)行反應(yīng)，可分為以啞鈴狀模板構(gòu)造的形成過程和擴(kuò)增循環(huán)2個步驟[14]。該方法簡單快速，與PCR技術(shù)相比，不需要復(fù)雜的設(shè)備和專業(yè)人員進(jìn)行操作，甚至可以在簡單的水浴裝置中進(jìn)行。在LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上，ZHANG等[13]結(jié)合磁敏免疫分析技術(shù)(magnetic immunocaptured-loop-mediated isothermal amplification assay，IC-LAMP)來檢測糞便樣品中的志賀氏菌，該方法能夠比傳統(tǒng)LAMP技術(shù)更有效地富集病原體細(xì)胞而無需提取基因組DNA，檢測限為8.7 cfu·mL-1，比PCR技術(shù)對志賀氏菌的檢測更為靈敏、特異且可靠。除此以外，等溫擴(kuò)增技術(shù)還包括雜交鏈反應(yīng)技術(shù)(hybridization chain reaction)[18]、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplification)[19]和鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(strand displacement amplification)等，這些技術(shù)對某些影響分子擴(kuò)增效率的抑制物質(zhì)的耐受性優(yōu)于PCR[20]。

3 基于免疫學(xué)的快速檢測方法

基于免疫學(xué)的快速檢測方法利用了特異性抗原-抗體反應(yīng)，針對目標(biāo)物的抗原或抗體對目標(biāo)物進(jìn)行定量、定性檢測[21]。該類方法包括酶聯(lián)免疫法，生物發(fā)光免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫法等，具有檢測速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢。

在免疫學(xué)方法中，酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是在病原體檢測方面使用最為廣泛方法之一。為了滿足測定需求，ELISA通?？煞譃橹苯覧LISA、夾心ELISA和競爭性ELISA(圖2)。直接ELISA首先將目標(biāo)分析物(抗原)粘附于平板表面，然后將酶標(biāo)記的抗原特異性結(jié)合，最后引入該酶的生色試劑產(chǎn)生顏色變化；夾心ELISA通常使用2種抗體，一種作為吸附劑固定以捕獲抗原，另一種通過酶標(biāo)記的抗體作為信號標(biāo)記產(chǎn)生顯色反應(yīng)；競爭性ELISA主要應(yīng)用于抗原缺乏抗體的結(jié)合位點，原理是標(biāo)記的抗體與樣品競爭抗原的結(jié)合位點[22]。在沙門氏菌、李斯特菌(Listeriaspp.)和大腸桿菌等多種食源性致病微生物的檢測中均借助了酶聯(lián)免疫方法，取得了很好的檢測效果。BOLTON等[23]研究了沙門氏菌的ELISA檢測，試劑盒的檢出限低至0.04 cfu·g-1。相比于培養(yǎng)法，基于免疫學(xué)的病原微生物檢測方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，是病原菌檢測中常用的方法；然而這些方法有耗時長、存在交叉反應(yīng)、產(chǎn)生假陰性等缺點。

4 基于生物傳感器的快速檢測方法

近年來，各種新型微生物檢測方法發(fā)展迅速，基于納米材料的生物傳感器在微生物快速檢測中表現(xiàn)出優(yōu)異性能，受到廣泛的研究關(guān)注。納米材料尺寸小、結(jié)構(gòu)可控、具有良好的生物相容性，可以利用其優(yōu)異的光學(xué)、電化學(xué)性質(zhì)檢測微生物的蛋白質(zhì)、DNA或RNA。此外，將納米材料與傳感器結(jié)合對微生物的目標(biāo)信號物進(jìn)行特異性識別檢測和信號傳遞有利于提高檢測的特異性和靈敏性[24-25]?；诳贵w、適配體等對細(xì)菌或病毒特定結(jié)構(gòu)的親和力，結(jié)合納米材料的信號放大和轉(zhuǎn)換作用，生物傳感器可實現(xiàn)對病原微生物的實時、原位、高靈敏度檢測。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法相比，該方法檢測速度快，多數(shù)情況下能在1 h左右得到結(jié)果。但該類技術(shù)仍處于發(fā)展階段，需要與可靠性強(qiáng)的檢測技術(shù)相結(jié)合，以獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

4.1 光學(xué)生物傳感器

光學(xué)生物傳感器通過熒光、散射、吸收等光學(xué)現(xiàn)象，借助信號轉(zhuǎn)換器將生物信號轉(zhuǎn)化為可分析的光信號；將與病原微生物特征物具有特異性反應(yīng)的抗原、抗體或適配體(檢測探針)修飾于光學(xué)材料上，通過檢測探針與特征物的結(jié)合引起光學(xué)特性變化，以此定量檢測病原微生物的濃度。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，光學(xué)生物傳感器檢測時間短、靈敏度高、無需具備專業(yè)知識的人員便可進(jìn)行快速檢測操作。光學(xué)生物傳感器按檢測原理可分為比色光學(xué)生物傳感器、表面離子共振生物傳感器、熒光生物傳感器等。

4.1.1比色光學(xué)生物傳感器

比色光學(xué)生物傳感器的檢測原理基于比色分析法。比色分析法是通過溶液本身的顏色對光的選擇性吸收，在特定波長范圍產(chǎn)生吸收并用肉眼觀察或光學(xué)儀器進(jìn)行分析的一種方法。利用這種方法可以通過肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果，簡化鑒定步驟。在比色生物傳感器中最具代表性的是側(cè)流層析技術(shù)(lateral flow assay，LFA)，該方法能夠在短時間內(nèi)得到檢測結(jié)果，適用于現(xiàn)場快速檢測。LFA技術(shù)雖作為一種即時現(xiàn)場檢測手段被廣泛運用，但仍存在靈敏度較低、定量檢測能力有限、無法重復(fù)利用等缺陷。在溶液樣品檢測方面，TRAM等[26]開發(fā)了一種試紙比色傳感方法，利用細(xì)菌的DNA酶探針作為分子識別元件，檢測過程中尿素通過脲酶水解增加溶液pH值；通過將脲酶與磁珠上的DNA酶偶聯(lián)，通過pH值的變化可檢測細(xì)菌的存在和濃度。由于其快速、簡單、結(jié)果易觀測，能夠適用于現(xiàn)場快速檢測，但該方法靈敏度較低，若要進(jìn)行更為準(zhǔn)確的檢測需要增加富集培養(yǎng)步驟。

4.1.2表面離子共振(surface plasmon resonance，SPR)生物傳感器

SPR傳感器通常由光源、接收器、棱鏡、偏振片、金屬膜以及能夠與檢測目標(biāo)物特異性結(jié)合的識別元件組成，光源發(fā)射入射光透過偏振片，以一定的角度射入棱鏡，激發(fā)金屬膜上的等離子體，當(dāng)負(fù)載在金屬膜表面的識別元件結(jié)合了目標(biāo)物后會引起表面的折射率發(fā)生變化，在檢測器中產(chǎn)生信號響應(yīng)，以此定量檢測目標(biāo)物的含量[27](圖3)。TORUN等[28]利用磁性納米顆粒對目標(biāo)物進(jìn)行分離，采用SPR傳感器對大腸桿菌進(jìn)行檢測，檢測限低至3 cfu·mL-1。將SPR技術(shù)與納米材料和其他檢測技術(shù)聯(lián)用能夠提高檢測靈敏度、響應(yīng)速度，優(yōu)化傳感器性能。ZHOU等[29]將免疫磁分離、免疫磁性試紙與SPR技術(shù)相結(jié)合，通過免疫磁分離富集副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，與PCR技術(shù)相比大幅提高了檢出限和檢出速度，檢測限為10 cfu·mL-1，能在55 min內(nèi)得到檢測結(jié)果。EL等[30]將MoS2-石墨烯復(fù)合材料與局部表面等離振子共振(localized surface plasmon resonance)生物傳感器相結(jié)合，大幅提高了傳感器的靈敏度。SPR生物傳感器是食源性致病菌檢測中應(yīng)用較多的一類生物傳感器，然而細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)與水的折射率相似，在一定程度上限制了檢測的準(zhǔn)確性，且SPR生物傳感器在實驗室分析中仍需要大型設(shè)備，可與微流控技術(shù)相結(jié)合來減小設(shè)備尺寸和降低檢測的復(fù)雜性[31]。

4.1.3熒光生物傳感器

熒光生物傳感器是基于熒光發(fā)生原理，當(dāng)目標(biāo)分析物受到紫外光照射時，原子被激發(fā)產(chǎn)生能級躍遷從而產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光強(qiáng)度從而實現(xiàn)對目標(biāo)物的定量分析。熒光生物傳感器設(shè)備簡單且響應(yīng)速度快，結(jié)合新型納米材料能消除背景熒光，提升信噪比[32]。SRINIVASAN等[33]設(shè)計了2種無標(biāo)記的熒光適體傳感器檢測鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)。第1種采用“熒光淬滅”方式，首先將適體插入SYBR核酸染料(SYBR GREEN I,SG)，產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號；加入鼠傷寒沙門氏菌，與適配體特異性結(jié)合并釋放SG，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度線性下降，這種方法獲得的最低檢測限為733 cfu·mL-1。第2種采用“熒光增強(qiáng)”方式，當(dāng)適體和金納米顆粒與羅丹明B(rhodamine B，RB)混合時，羅丹明的熒光通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(forster resonance energy transfer，F(xiàn)RET)并被顯著淬滅；加入鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)，與適配體特異性結(jié)合，導(dǎo)致淬滅的羅丹明B的熒光恢復(fù)，從而通過熒光信號強(qiáng)度變化對鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行檢測，最低檢測限為464 cfu·mL-1。

HU等[34]設(shè)計了一種納米熒光微球用于快速檢測大腸桿菌O157:H7，通過化學(xué)方法將熒光素固定于SiO2納米微球內(nèi)，并將針對大腸桿菌O157:H7的抗體修飾于磁珠和SiO2納米微球表面，從而用于識別和捕獲大腸桿菌O157:H7。通過磁分離富集后加入NaOH以釋放SiO2微球中的熒光素來檢測大腸桿菌O157:H7的濃度。在最優(yōu)條件下，該方法的檢測限低至3 cfu·mL-1，檢測過程可在75 min內(nèi)完成。熒光生物傳感器在實際檢測應(yīng)用中常以試劑盒和試紙條的形式出現(xiàn)，靈敏度高、檢測時間短、操作簡便。

4.2 電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)傳感器一般由換能器和識別元件等組成，其中識別元件與病原體微生物的目標(biāo)檢測物特異性結(jié)合，引發(fā)電化學(xué)系統(tǒng)中的阻抗、電流等的變化，通過電信號的測量來檢測病原微生物的濃度，其組件與檢測模式如圖4所示[35]。

4.2.1安培型/伏安型生物傳感器

安培型傳感器檢測病原微生物的基本工作原理是在給定的電勢下測定電極表面由氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生的電流，分析物濃度與電流值呈線性關(guān)系[36]，與之對應(yīng)的伏安型生物傳感器則在電勢掃描下測定對應(yīng)的電流，生成的伏安圖中電流強(qiáng)度與分析物的濃度成正比。另外，伏安法的類型根據(jù)電勢的控制形式可分為差分脈沖伏安法、循環(huán)伏安法和方波伏安法[37]。

根據(jù)安培型生物傳感器的檢測原理，目前已經(jīng)開發(fā)了一系列用于檢測病原微生物的相關(guān)傳感器。SAVAS等[38]開發(fā)了一種能夠檢測糞便樣本中痕量的鼠傷寒沙門氏菌的傳感器，基于免疫學(xué)原理對DNA探針和目標(biāo)物菌用辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase)標(biāo)記，在固定電勢下連續(xù)測量電流，以檢測固定在傳感器表面的DNA探針與目標(biāo)物之間發(fā)生的雜交反應(yīng)，從而定量檢測鼠傷寒沙門氏菌的DNA濃度，檢測限低至1 cfu·mL-1。在安培型生物傳感器中，石墨烯也常被用做通道材料將生物信號轉(zhuǎn)換為電學(xué)信號。HUANG等[39]設(shè)計了一種基于石墨烯的生物傳感器，能夠以高靈敏度和特異性檢測大腸桿菌。通過化學(xué)氣相沉積法生長大尺寸石墨烯薄膜，通過連接子將大腸桿菌抗體修飾于石墨烯薄膜上，未防止非特異性反應(yīng)，使用乙醇胺將未反應(yīng)的連接子分子猝滅，同時使用吐溫20將未涂覆石墨烯的區(qū)域覆蓋，最后利用抗體與大腸桿菌的抗原-抗體特異性反應(yīng)對大腸桿菌進(jìn)行特異性識別，檢測限低至10 cfu·mL-1(圖5)。ODUNDO等[40]根據(jù)免疫學(xué)原理研發(fā)了一種能夠檢測糞便樣本中血吸蟲抗原的伏安型生物傳感器，由納米帶、金納米顆粒以及血吸蟲抗原組成。將血吸蟲抗原負(fù)載在金納米顆粒上，在檢測過程中抗原與血吸蟲抗體特異性結(jié)合，利用循環(huán)伏安法進(jìn)行分析，檢測限低至8.4×10-2ng·mL-1。

4.2.2阻抗型生物傳感器

阻抗型生物傳感器利用電化學(xué)阻抗譜(electrochemical impedance spectroscopy，EIS)對電化學(xué)系統(tǒng)施加一個頻率變化的交流信號，通過測量交流信號中電壓與電流的比值，即阻抗值來分析目標(biāo)物。EIS對檢測界面非常敏感，因此可以用于表征生物傳感器構(gòu)建過程中各種反應(yīng)的特性[37]。在生物傳感器中通常利用能夠與目標(biāo)檢測物特異性結(jié)合的探針增強(qiáng)傳感器的靈敏性和特異性。MALVANO等[41]設(shè)計了一種基于乳鏈菌肽的阻抗型生物傳感器。乳鏈菌肽是一種抗微生物肽，可以攻擊細(xì)菌并破壞其細(xì)胞膜，在生物傳感器中可用作分子識別元件。將乳鏈菌肽分子固定在金電極上，利用電化學(xué)阻抗譜研究該傳感器對不同細(xì)菌的響應(yīng)情況。在檢測沙門氏菌細(xì)胞時檢測限低至1.5×101cfu·mL-1。SHI等[42]采用對大腸桿菌O157:H7具有高親和力的聚合肽作為識別原件，經(jīng)修飾后在金電極上進(jìn)行自組裝，之后利用阻抗譜分析大腸桿菌O157:H7，其檢測限低至20 cfu·mL-1。在阻抗型生物傳感器中，石墨烯由于其高比表面積、優(yōu)異的導(dǎo)電性能以及可修飾性，也常被用作檢測材料。JAISWAL等[43]將羧基化的石墨烯與氧化鋅納米棒結(jié)合，并在電極表面固定大腸桿菌O157:H7的特異性DNA探針，以檢測大腸桿菌O157:H7。GUPTA等[44]利用絲網(wǎng)印刷技術(shù)，將氧化石墨烯制備成電極，并在其表面用2-氨基對苯二甲酸進(jìn)行功能化，利用抗原-抗體反應(yīng)對大腸桿菌進(jìn)行檢測。該傳感器檢測限低至2 cfu·mL-1，且響應(yīng)速度快(檢測時間少于4 min)，穩(wěn)定性好(2個月)。

4.3 微流控技術(shù)在生物傳感器中的應(yīng)用

近年來，微流控技術(shù)發(fā)展迅速，廣泛運用于生物樣品的快速檢測。生物傳感器與微流體集成的檢測系統(tǒng)能夠在單一設(shè)備上進(jìn)行樣品的添加、分離、制備和分析，具有檢測時間短、多通量、自動化、便攜性，多功能性和所需樣品量小等多種優(yōu)點[45]。ZHAO等[14]開發(fā)的微流控芯片可以與樣品分析單元相結(jié)合(如生物傳感器等)，簡化樣品處理步驟，在設(shè)計便攜式糞便診斷平臺方面具有廣闊的應(yīng)用前景。MCGUIRE等[46]對糞便樣品進(jìn)行加熱揮發(fā)處理，通過氣相色譜方法并結(jié)合電子鼻技術(shù)，對艱難梭菌(Clostridiumdifficile)進(jìn)行檢測。微流控技術(shù)能夠從復(fù)雜樣品中有效分離致病菌，進(jìn)而便于病原體的精確檢測。將微流控技術(shù)與生物傳感器技術(shù)相結(jié)合，有望開發(fā)更為實用的便攜式現(xiàn)場病原微生物檢測設(shè)備，滿足疾病控制、食品、環(huán)境監(jiān)控等方面的需求。

5 檢測方法對比

前文介紹了糞便中病原微生物快速檢測方法，表1對這些方法的優(yōu)缺點進(jìn)行了總結(jié)。傳統(tǒng)的培養(yǎng)鏡檢法能夠準(zhǔn)確地檢測常見微生物種類，但缺點在于微生物培養(yǎng)時間較長，通常在5～7 d內(nèi)才能給出檢測結(jié)果。相較于培養(yǎng)鏡檢法，核酸檢測方法、免疫學(xué)檢測方法和生物傳感器檢測方法往往能夠快速得到檢測結(jié)果。其中光學(xué)生物傳感器和電化學(xué)生物傳感器檢測尤為方便，結(jié)合微流控技術(shù)能夠快速分析成分復(fù)雜的糞便樣品。

表1 糞便中病原微生物快速檢測方法優(yōu)缺點對比Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of fast detection methods for pathogenic microorganisms in faeces

表2總結(jié)了糞便中病原微生物快速檢測方法的各項指標(biāo)，表中提到的檢測方法均能在2 h內(nèi)完成檢測。生物傳感器由于檢測結(jié)構(gòu)、識別元件、換能器等各不相同，其性能相差明顯，對不同目標(biāo)檢測物的檢測時間由2 min到2 h不等。通過設(shè)計不同的識別元件，生物傳感器能夠檢測不同的微生物；另外選擇合適的納米材料作為換能器能夠大幅提高傳感器的檢測性能。因此，生物傳感器在病原微生物檢測方面有望得到進(jìn)一步研究和推廣。

表2 糞便中病原微生物檢測方法對比Table 2 Comparison of detection methods for pathogenic microorganisms in faeces

6 總結(jié)與展望

針對糞便中病原微生物的檢測，傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測法依然是常用且準(zhǔn)確有效的檢測方法。但由于該方法需要耗費較長時間進(jìn)行微生物培養(yǎng)，操作步驟繁多，難以滿足快速檢測需求。該文根據(jù)檢測原理，介紹了核酸檢測法、免疫學(xué)檢測法和生物傳感器檢測法。相較于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測法，這些方法通常能在數(shù)小時內(nèi)完成對目標(biāo)物的檢測。

核酸檢測法主要依靠核酸的擴(kuò)增，通過對于特定的基因片段擴(kuò)增最終得到基因序列，與已知的目標(biāo)微生物的核酸序列比對便可鑒定檢測微生物類別[47]。近年來，核酸檢測法在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)得到了充分的實踐應(yīng)用，在新冠疫情的鑒定排查方面，許多國家也運用該方法研制了相應(yīng)的核酸試劑盒來對疑似感染者進(jìn)行篩查。核酸檢測技術(shù)作為微生物檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，有著特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點，但需要在實驗室進(jìn)行分析，難以滿足現(xiàn)場檢測需求。免疫學(xué)檢測方法基于抗原-抗體反應(yīng)原理，檢測結(jié)果較為可靠，但同樣依賴實驗室條件，這限制了其在現(xiàn)場原位檢測的應(yīng)用。生物傳感器基于光學(xué)、電學(xué)分析原理，能夠特異性檢測目標(biāo)病原微生物，同時具備高靈敏度，并且具有成本低、檢測過程簡單、無需專業(yè)人員操作，可現(xiàn)場快速檢測等優(yōu)勢。但目前多數(shù)生物傳感器對糞便樣品的檢測仍處于研究階段，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各種不同的傳感器設(shè)計結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其性能差異巨大。如何提高傳感器的重復(fù)性、穩(wěn)定性和抗干擾能力，使其能夠方便地應(yīng)用于實際檢測當(dāng)中是需要解決的問題。另外，生物傳感器往往對分析樣品的條件狀態(tài)有一定限制，因此糞便樣品的快速前處理方法也是亟需研究的問題之一。生物傳感器結(jié)構(gòu)設(shè)計靈活，通過結(jié)合性能優(yōu)異的納米功能材料，這類傳感器顯現(xiàn)出極高的檢測能力，具有巨大的研究價值和應(yīng)用潛力。