苗金雪，馬旭冉，馮雪，李晗，王嵐，高曦，張良，宋紅新，王敦方，劉雅清，李佳，楊偉鵬，*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；3.清華大學(xué)，北京 100083)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性炎癥性疾病，好發(fā)于中青年，臨床表現(xiàn)為持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便伴腹痛、里急后重和不同程度的全身癥狀，病程多在4～6周以上[1]，嚴重影響患者生活質(zhì)量。黃芩湯源于張仲景的《傷寒論》，由黃芩、芍藥、大棗及甘草4味藥組成，其主治為“自下利”，具有清熱止痢、和中降逆的功效，被歷代醫(yī)家奉為治痢祖方，在臨床上被廣泛應(yīng)用于潰瘍性結(jié)腸炎及結(jié)腸癌等消化系統(tǒng)疾病。近年來，課題組一直致力于對黃芩湯的研究。有研究表明，人前梯度蛋白2(anterior gradient-2,AGR2) 基因可抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 誘導(dǎo)的腸黏膜屏障損傷，保護線粒體功能，這種保護作用可能是通過誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生實現(xiàn)的[2]；自噬可通過調(diào)節(jié)腸道菌群和黏液分泌來維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，達到減輕UC的作用[3]。臨床上也有案例表明潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸組織中存在線粒體自噬現(xiàn)象，且其主要通路蛋白PINK1與Parkin的表達量也存在差異,推測PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬可能是潰瘍性結(jié)腸炎的潛在保護機制[4]。本實驗擬從黃芩湯對PINK1和Parkin蛋白表達的影響入手，探究黃芩湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中線粒體自噬的影響。

1 實驗材料與研究方法

1.1 動物

SPF級健康SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(190±10)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0011。動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所清潔級動物房，溫度為(22±2.5)℃，濕度為(40±20)%。

1.2 藥品與試劑

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、芍藥(PaeonialactifloraPall)、炙甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)和大棗(ZiziphusjujubaMill)飲片均購于北京華邈藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定為合格藥材。黃芩湯煎劑按照文獻方法制得[5]。2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-Benzenesulfonic acid ,TNBS,美國sigma公司)；柳氮磺胺吡啶腸溶片(salazosulfapyridine，SASP，批號：09200506，上海信誼天平藥業(yè)有限公司)；兔抗鼠PINK1單克隆抗體、兔抗鼠Parkin單克隆抗體(美國CST公司，貨號分別為6946T、2132S)。

1.3 實驗儀器

電泳儀(美國Bio-Rad公司);搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);發(fā)光儀(Clinx Science Instruments);CKX41 OLYMPUS倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司);渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造公司);電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科儀器有限公司)。

1.4 造模方法

采用Morris等[6]文獻報道的造模方法制備UC大鼠模型，在適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，禁食不禁水24 h，大鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(40～60 mg/kg)進行麻醉,然后將TNBS混合溶劑(TNBS 0.18 mL/100 g+50%乙醇 0.25 mL)注入大鼠肛門內(nèi)約8 cm處，然后立刻將大鼠倒置，捏緊肛門，防止溶劑流出。正常組麻醉后給予同體積的生理鹽水，后續(xù)操作與造模大鼠相同。造模結(jié)束約3 h后大鼠陸續(xù)開始恢復(fù)意識，術(shù)后進行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 實驗分組及樣本的采集

大鼠按照體質(zhì)量隨機分為6組，分別為正常組、模型組、陽性藥SASP組(為0.5 g/kg)和黃芩湯高、中、低劑量組(20 、10、5 g/kg)。造模后第4天開始灌胃給藥，模型組給予等體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h，然后進行眼眶取血，注意小心操作，避免溶血，所取得的大鼠血液以3 000 r/min離心15 min后，吸取分離上層血清，冷凍于-20 ℃?zhèn)溆?。取血后脫頸處死大鼠，解剖取出結(jié)腸組織，生理鹽水清洗腸道內(nèi)容物，將腸段分為3部分，一部分凍存于-80 ℃?zhèn)溆?，一部分?0%多聚甲醛固定，留作后續(xù)的病理切片及HE染色，一部分用4%的戊二醛固定，4 ℃保存，留作電鏡觀察。

2 檢測指標及方法

2.1 行為學(xué)指標

觀察造模前后及給藥前后的大鼠精神狀態(tài)、行為體征、糞便性狀，記錄其進食量及體質(zhì)量，按UC活動指數(shù)(DAI)評分標準[7]進行評分，評分標準如下：體質(zhì)量無下降，大便性狀正常，無便血，記0分；體質(zhì)量下降<5%，大便略松散，有隱性出血，記1分；體質(zhì)量下降<10%，大便松散，肉眼可見出血，記2分；體質(zhì)量下降≥10%，腹瀉，血便，記3分。

2.2 病理學(xué)指標

高倍鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)。取甲醛固定好的結(jié)腸組織，進行包埋、切片、HE染色，高倍鏡下選取視野，根據(jù)病變損傷程度進行評分，評分標準[8]如下：未見明顯損傷，記0分；10%高倍鏡視野中呈低水平淋巴細胞浸潤，腸絨毛結(jié)構(gòu)無破壞，記1分；10%～25%高倍鏡視野中呈中等水平淋巴細胞浸潤，腸隱窩加深，腸壁增厚單位侵及肌層，無潰瘍，記2分；25%～50%高倍鏡視野中呈高水平淋巴細胞浸潤，血管增生，腸壁增厚且侵及肌層，無潰瘍，記3分；明顯的淋巴細胞浸潤，血管增生，腸隱窩加深變形，腸壁增厚且侵及肌層，伴潰瘍，記4分。

2.3 黃芩湯對大鼠結(jié)腸組織中線粒體自噬的影響

將固定在4%戊二醛中的結(jié)腸組織進行切片、固定、梯度脫水、包埋、固化、切成超薄片、醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色，進行透射電鏡觀察和拍照。

2.4 黃芩湯對大鼠結(jié)腸中PINK1、Parkin表達的影響

將大鼠的結(jié)腸組織充分裂解后提取總蛋白， BCA試劑盒檢測組織中的蛋白濃度，按照所得濃度以不同比例加入蛋白上樣緩沖液，蛋白樣品變性，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，TBST洗膜，加入PINK1和Parkin抗體，4 ℃反應(yīng)過夜后二次洗滌，加入相應(yīng)的二抗并在室溫下孵育2 h，再次洗滌后加入發(fā)光液曝光，圖片掃描，分析條帶灰度值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)指標

造模后的大鼠出現(xiàn)不同程度的精神萎靡，倦怠嗜臥，被毛蓬亂無光澤，食欲下降，體質(zhì)量減輕，糞便不成形，個別大鼠出現(xiàn)膿血便。在給藥7 d后，各給藥組的體質(zhì)量及食量與模型組相比均有不同程度的增加，尤其以SASP組和黃芩湯中劑量組改善明顯，模型組并未出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)。大鼠DAI評分見表1,進食量及體質(zhì)量統(tǒng)計結(jié)果見圖1、2。

表1 各組大鼠造模后DAI評分分)

圖1 黃芩湯對UC大鼠體質(zhì)量的影響

圖2 黃芩湯對UC大鼠進食量的影響

3.2 病理學(xué)指標

肉眼觀察UC大鼠的結(jié)腸組織，正常組結(jié)腸組織外觀正常，顏色正常，未見充血，漿膜面、黏膜面及肌層未見明顯病變，模型組大鼠結(jié)腸組織存在充血現(xiàn)象，外觀顏色發(fā)生改變，呈現(xiàn)紅褐色，腸黏膜及肌層明顯變薄，個別大鼠結(jié)腸與周邊組織發(fā)生黏連，并伴有惡臭味，陽性藥SASP組未見明顯的充血現(xiàn)象，病變程度減輕，黃芩湯3個劑量組大鼠結(jié)腸組織外觀顏色、充血及肌層厚度等與模型組相比均有不同程度的改善，見圖3。HE染色結(jié)果見圖4，結(jié)腸組織病理評分結(jié)果見表2。

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織對比

注:A：正常組;B:模型組;C：陽性藥SASP組;D：高劑量組;E：中劑量組;F：低劑量組。圖4 各組大鼠結(jié)腸組織病理切片(100×)

表2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分分)

鏡下觀察結(jié)腸組織：正常組大鼠結(jié)腸黏膜完整，絨毛排列整齊，未見壞死、脫落，肌層結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠明顯可見炎細胞浸潤，結(jié)構(gòu)腺體消失，杯狀細胞明顯減少，腸絨毛腫脹而短小，黏連成片甚至缺失，黏膜層變薄。黃芩湯三個劑量組與模型組相比結(jié)腸黏膜炎性細胞浸潤數(shù)量明顯減少，腸壁結(jié)構(gòu)紊亂程度減輕，病理變化得到不同程度的改善，其中以黃芩湯中劑量組最為明顯。

3.3 黃芩湯對大鼠結(jié)腸組織線粒體自噬的影響

透射電鏡下觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)，正常組線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，體積正常，線粒體嵴結(jié)構(gòu)完整，邊緣整齊。而模型組可觀察到線粒體腫脹，體積增大，嵴變短并且邊移，基質(zhì)顆粒減少，可觀察到空化現(xiàn)象。各給藥組也可觀察到不同程度的線粒體結(jié)構(gòu)損傷及自噬現(xiàn)象的發(fā)生，可見自噬小體與自噬溶酶體。結(jié)果見圖5。

注:A：正常組;B:模型組;C：陽性藥SASP組;D：高劑量組;E：中劑量組;F：低劑量組。圖5 黃芩湯對UC大鼠結(jié)腸組織中線粒體自噬的影響

3.4 黃芩湯對UC大鼠結(jié)腸組織中PINK1/Parkin蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果如圖6和圖7所示。UC模型組大鼠結(jié)腸組織中Parkin蛋白的表達量低于正常組(P<0.01)，陽性藥組與黃芩湯各劑量組中PINK1與Parkin的表達量均有不同程度的升高，提示給藥后大鼠的線粒體自噬強度增強，結(jié)果可見表3。模型組中PINK1蛋白表達量較正常組增加，其可能原因為線粒體損傷后該蛋白無法進入線粒體內(nèi)被降解，大量聚集在線粒體外膜。

注：A：正常組;B:模型組;C：陽性藥組;D：高劑量組;E：中劑量組;F：低劑量組;與正常組比較，△P<0.05,△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。圖6 黃芩湯對結(jié)腸組織中PINK1表達量的影響

注：A：正常組;B:模型組;C：陽性藥組;D：高劑量組;E：中劑量組;F：低劑量組;與正常組比較，△P<0.05, △△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。圖7 黃芩湯對結(jié)腸組織Parkin表達量的影響

表3 黃芩湯對UC大鼠組織中PINK1和Parkin蛋白表達的影響

4 討論

線粒體在細胞的生命活動過程中起著至關(guān)重要的作用，它不僅能為細胞的生命活動提供能量與生物合成的底物，還可以清除掉胞內(nèi)損傷或衰老的細胞器及線粒體受損時產(chǎn)生的過量線粒體反應(yīng)活性氧類(mitochondrial reactive oxygen species，mtROS)，減輕線粒體損傷對細胞的傷害，維持線粒體內(nèi)的動態(tài)平衡，保障生命活動的順利進行，這一過程被稱為線粒體自噬。同時，線粒體還是固有免疫反應(yīng)最基本的信號平臺之一[9]，在調(diào)節(jié)細胞對應(yīng)激源的適應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，包括受損的生物發(fā)生、線粒體DNA損傷、衰老、營養(yǎng)限制以及分裂與融合之間的平衡失常，如果不加以控制，這些過程會通過活性氧對核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)造成損傷，導(dǎo)致持續(xù)的氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激通過轉(zhuǎn)錄后修飾(包括泛素化)來調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)，這反過來又導(dǎo)致受損的線粒體的聚集，最終導(dǎo)致細胞死亡和更廣泛的組織功能障礙[10]，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。另一方面，線粒體自噬與炎癥似乎也有著密切的聯(lián)系，線粒體ROS可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子、腺苷酸活化蛋白激酶、一氧化氮合成酶等轉(zhuǎn)錄因子，共同參與炎癥調(diào)控[11]，在炎癥過程中，線粒體既是ROS的重要來源，又是其損傷靶點，二者交互作用，形成惡性循環(huán)，共同調(diào)控機體炎性反應(yīng)[12]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芩湯可以發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[13]，減少細胞內(nèi)過氧化產(chǎn)物的累積，并且能夠抑制細胞炎性因子的表達[14-15]，據(jù)此提出假設(shè)，黃芩湯能夠緩解潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能與調(diào)控線粒體的自噬水平有關(guān)。

PINK1/Parkin通路是目前研究較多的線粒體自噬通路，其表達量在一定程度上反映了線粒體自噬的水平。有研究證實，PINK1和Parkin蛋白可以通過清除受損線粒體來預(yù)防炎癥[16-17]。PINK1是一種有581個氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在正常生理狀態(tài)的線粒體中，PINK1會不斷地被轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)膜，被線粒體內(nèi)膜蛋白酶切割清除，因此，正常情況下PINK1在細胞中保持著較低水平。Parkin是一種具有465個氨基酸的E3泛素連接酶，具有連接酶活性。在機體受到應(yīng)激源刺激時，線粒體膜電位發(fā)生去極化，氧化呼吸異常，產(chǎn)生大量ROS引起線粒體氧化損傷，PINK1進入線粒體的路徑被阻斷，聚集于線粒體外膜，并將Parkin募集至線粒體[18]，構(gòu)建多聚泛素鏈泛素化線粒體相關(guān)成分蛋白與自噬受體蛋白結(jié)合，同時，受體蛋白的LIR(LC3相互作用區(qū)域)與錨定于自噬囊泡上的微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtublue associated protein light chain 3,LC3)結(jié)合，構(gòu)成線粒體自噬體，而后與溶酶體結(jié)合成線粒體自噬溶酶體，最終被水解酶水解[19]。因此當線粒體穩(wěn)態(tài)遭到破壞時，PINK1在組織中大量聚集，這與實驗結(jié)果中Western Blot法檢測到模型組大鼠組織中PINK1蛋白的表達量增多的現(xiàn)象符合，線粒體自噬啟動時，PINK1蛋白會聚集Parkin蛋白于線粒體外模上，導(dǎo)致組織中的Parkin表達量增多。綜上所述，黃芩湯可以促進潰瘍性結(jié)腸炎大鼠組織中PINK1和Parkin蛋白表達。

本次實驗通過對PINK1/Parkin自噬通路相關(guān)位點蛋白的檢測，探究黃芩湯對UC大鼠組織中線粒體自噬的影響。實驗結(jié)果顯示，黃芩湯可以明顯改善UC模型大鼠的體征及DAI評分，電鏡觀察到各給藥組大鼠組織中自噬小泡與溶酶體等線粒體自噬結(jié)構(gòu)，說明組織中發(fā)生了線粒體自噬，并且PINK1與Parkin的表達量明顯增加，說明給藥后大鼠結(jié)腸組織中PINK1/Parkin自噬通路被激活，啟動線粒體自噬，提示黃芩湯可能通過影響PINK1和Parkin蛋白的表達，激活線粒體自噬，清除組織內(nèi)受損的線粒體，從而達到治療潰瘍性結(jié)腸炎的效果。