程英龍，馬曉榮，胡喜姣，劉麗

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

衣原體感染和淋病等性傳播疾病都有導(dǎo)致盆腔炎性疾病和不孕癥的可能性[1]。截止到2013年全球不孕癥的患病率達(dá)到15%，我國(guó)不孕癥的發(fā)病率也有逐年上升的趨勢(shì)[2]。其中輸卵管性不孕占不孕女性的30%～40%[3-4]。不孕癥作為生活的一個(gè)負(fù)性事件嚴(yán)重影響著患者及家屬的身心健康，甚至成為對(duì)家庭穩(wěn)定具有極大威脅的因素。不孕癥的治療在臨床上取得了較好的療效，這其中包括西醫(yī)的輔助生殖技術(shù)、宮腹腔鏡等手術(shù)治療手段，因其存在一定的局限性很難在臨床治療中推廣普及。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究證明了GD可以明顯改善患者的IL-2、IL-6、TNF-α等炎性因子的表達(dá)水平，從而對(duì)輸卵管炎性不孕癥起到積極的治療作用[5-7]?，F(xiàn)在原課題的研究結(jié)果基礎(chǔ)上，通過(guò)觀察GD對(duì)模型大鼠中醫(yī)證候評(píng)分、血流變、DA和NE的表達(dá)水平、輸卵管病理表現(xiàn)及輸卵管組織形態(tài)來(lái)探討GD治療氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕癥的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠100只，鼠齡56～84 d，體質(zhì)量(200±20)g，實(shí)驗(yàn)大鼠均來(lái)源于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，編號(hào):SCXK(黑) 2015-004。將大鼠飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度為20～22 ℃，相對(duì)濕度保持在40%左右，8:00—20:00人工照明12 h，分籠飼養(yǎng)，5只/籠，標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)飼料，自由飲水。

1.2 試劑與藥品

金黃色葡萄球菌：菌號(hào)FSCC223005，濃度為4×109/mL，北京東方賽瑞生物技術(shù)有限公司；DA、NE酶聯(lián)免疫試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司；水合氯醛、烏拉坦：上海山浦化工有限公司；膈下逐瘀湯加減方：延胡索、赤芍各20 g，牡丹皮、桃仁、川芎、枳殼、香附、烏藥、地龍、鱉甲各15 g(草藥均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中草藥局提供，藥品制備：以上飲片，按比例水煎煮，10倍量水一煎，8倍量水二煎，合并兩煎藥液， 水煎液濃縮適當(dāng)濃度移至蒸發(fā)皿中，最后移至真空干燥箱中干燥至衡重，得膈下逐瘀加減方水煎液干粉以保證藥物的穩(wěn)定性)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

SGD-1聲、光、電刺激儀(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)研究室研制)；KDC-16HR高速低溫離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；LBY-N6 Compact全自動(dòng)血液流變儀(北京普利生儀器有限公司)；透射電鏡(JEM-1220，日本電子有限公司)；光學(xué)顯微鏡(CX41，日本OLYMPUS公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將100只SD大鼠隨機(jī)分為空白組(K)、病證結(jié)合組(B)、膈下逐瘀湯高劑量組(H)、膈下逐瘀湯中劑量組(M)、膈下逐瘀湯低劑量組(L)，每組20只。

2.2 模型制備及干預(yù)

實(shí)驗(yàn)第1天，K組不予處理，B組及H、M、L組進(jìn)行手術(shù)造模。將10%水合氯醛按0.4 mL/100 g對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒后取近脊柱側(cè)肋緣過(guò)腎區(qū)約5 mm處，開(kāi)長(zhǎng)約1 cm左右橫切口，開(kāi)腹后剝離周圍組織，暴露子宮、輸卵管及卵巢，然后向輸卵管-卵巢方向注入金黃色葡萄球菌懸液0.1 mL，術(shù)畢逐層關(guān)腹，再次進(jìn)行術(shù)區(qū)消毒。對(duì)側(cè)輸卵管操作同上。疾病造模后恢復(fù)7 d，開(kāi)始制備氣滯血瘀證候模型，給予B組、H、M及L組大鼠聲、光、電+夾尾刺激，連續(xù)刺激21 d。具體刺激方法為：大鼠足底電擊刺激，電擊強(qiáng)度為25～35 V，每次持續(xù)電擊時(shí)間為1 min；噪聲刺激5～15 kHz，噪音刺激每次持續(xù)1 min；閃爍光刺激：以1～3 kHz的強(qiáng)度給予大鼠刺激，每次刺激持續(xù)時(shí)間為1 min，聲、光、電刺激均是每間隔15 min刺激1次。應(yīng)用以上3種刺激方法對(duì)大鼠進(jìn)行循環(huán)刺激，共刺激10 h/d；夾尾:1次/h，每次刺激時(shí)間為4 min，8次/d。藥物干預(yù)方法：治療組分別按膈下逐瘀湯加減方高、中、低劑量組分別給予模型大鼠灌胃膈下逐瘀湯加減方水煎液濃縮干粉，加水制成相當(dāng)于高劑量1.50 g/mL，中劑量0.75 g/mL，低劑量0.38 g/mL的混懸液；大鼠灌胃劑量按照0.02 mL/g鼠質(zhì)量給藥。模型對(duì)照組灌服等劑量蒸餾水，在造模第29天開(kāi)始，每日上午9:00行灌胃1次，連續(xù)給藥4周。

2.3 取材方法及檢測(cè)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)給藥治療28 d后，大鼠禁食不禁水12 h，次日9:00用20%烏拉坦(1 mL/100 g)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉后，行腹主動(dòng)脈采血，一部分血樣用于測(cè)定血流變各項(xiàng)指標(biāo)，余下血樣靜置4 h( 溫度為4 ℃)，按4 000 r/min低溫離心10 min后取其血清，按照酶連免疫法試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行DA、NE含量測(cè)定。取模型大鼠雙側(cè)輸卵管組織，行HE染色制備病例切片及進(jìn)行電鏡觀察輸卵管組織形態(tài)。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 GD對(duì)模型大鼠中醫(yī)證候積分的影響

與K組相比，B組中醫(yī)證候積分有顯著差異(P<0.01)，表明模型制備成功。

與B組相比較，H、M組中醫(yī)證候積分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，說(shuō)明高、中濃度GD均能明顯降低模型大鼠的氣滯血瘀證候評(píng)分。見(jiàn)表1。

表1 氣滯血瘀證候總積分

3.2 GD對(duì)模型大鼠血流變指標(biāo)影響

與K組相比，B組的血漿黏度、全血黏度30及還原黏度3.0均極顯著升高，P<0.01；與B相比，H、M兩組全血黏度30、血漿黏度和還原黏度3.0下降極其顯著，P<0.01，L組能明顯下調(diào)還原黏度3.0，P<0.05，血漿黏度、全血黏度3.0下降極其顯著，P<0.01。見(jiàn)表2。

表2 GD對(duì)大鼠血漿黏度、全血黏度3.0、還原黏度3.0的影響

3.3 GD對(duì)模型大鼠DA、NE表達(dá)的影響

與K組相比，B組DA、NE表達(dá)水平均有顯著差異(P<0.05)；與B組比較，H、M組的DA、NE差異現(xiàn)顯著(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 GD對(duì)大鼠血清DA、NE表達(dá)的影響

3.4 GD對(duì)模型大鼠輸卵管病理學(xué)影響

B組大鼠輸卵管細(xì)胞排列較紊亂，胞體腫脹，部分細(xì)胞核腫脹，細(xì)胞黏連充血；H組：輸卵管管腔上皮輕度脫落，輸卵管周圍可見(jiàn)少量炎細(xì)胞；M組：輸卵管管腔內(nèi)可見(jiàn)滲出液，輸卵管周圍大量炎細(xì)胞，胞體輕度腫脹；L組：輸卵管管腔少量炎細(xì)胞，上皮細(xì)胞脫落，部分壞死，輸卵管周圍少量炎細(xì)胞，胞體腫脹明顯。見(jiàn)圖1。

3.5 電鏡觀察GD對(duì)模型大鼠輸卵管病變的影響

K組：輸卵管組織形態(tài)完好，無(wú)明顯實(shí)質(zhì)性變性、壞死，纖毛豐富，輸卵管管腔無(wú)狹窄，無(wú)結(jié)締組織增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。B組：大鼠輸卵管均呈現(xiàn)不同程度的病態(tài)組織形態(tài)，4例較為嚴(yán)重。

H、M、L三組(其余各治療組)：輸卵管組織形態(tài)均有著不同程度的改善作用。見(jiàn)表4。

注：K.空白組;B.病證結(jié)合組;H.GD高劑量組;M.GD中劑量組;L.GD低劑量組。圖1 各組大鼠輸卵管HE染色圖(×400)

表4 電鏡觀察輸卵管組織形態(tài)學(xué)結(jié)果

4 討論

“氣滯血瘀證”是輸卵管炎性不孕最為常見(jiàn)的證型[8]。因此課題組對(duì)氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕癥作為重點(diǎn)研究。本研究所用方劑是在膈下逐瘀湯原方的基礎(chǔ)上去五靈脂、紅花、當(dāng)歸、甘草，加地龍、鱉甲二味而成膈下逐瘀湯加減方。方中牡丹皮可涼血活血，為君藥，配以烏藥，有補(bǔ)有泄。赤芍止痛散瘀、清熱涼血，是為臣。 鱉甲軟堅(jiān)散結(jié)，與牡丹皮、桃仁相配，可化瘀除癥，通管腔之塞物；川芎配伍枳殼，活血、行氣、消瘀滯；地龍配川芎，活絡(luò)通經(jīng)；延胡索、香附、烏藥皆入肝經(jīng)，共奏開(kāi)郁行氣、散結(jié)止痛之功。劉師應(yīng)用該方并以“活血化瘀，行氣止痛”為法，在臨床治療輸卵管炎性不孕時(shí)，療效頗佳。課題組前期研究表明GD可以明顯改善患者的IL-2、IL-6、TNF-α等炎性因子的表達(dá)水平，減少對(duì)輸卵管損傷，發(fā)揮其抗炎、抑制輸卵管黏連及纖維化，從而對(duì)輸卵管炎不孕癥起到積極的治療作用。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察GD對(duì)模型大鼠中醫(yī)證候評(píng)分、血流變、DA和NE的表達(dá)水平、輸卵管病理表現(xiàn)及輸卵管組織形態(tài)來(lái)探討GD治療氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕癥的作用機(jī)制。

血流變[9]在中醫(yī)血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)中是一項(xiàng)重要內(nèi)容。因此，血液流變學(xué)是可以作為藥物對(duì)血瘀證改善程度的一項(xiàng)客觀指標(biāo)[10]。本研究結(jié)果顯示，高、中、低劑量的GD均能夠在不同程度上改善模型大鼠血流變學(xué)指標(biāo)。這從血液流變學(xué)角度證實(shí)了GD能夠改善模型大鼠的“血瘀”狀態(tài)。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是中樞神經(jīng)遞質(zhì)，其所代謝的產(chǎn)物對(duì)神經(jīng)、內(nèi)分泌等系統(tǒng)均具有調(diào)節(jié)作用，并且對(duì)情緒、睡眠覺(jué)醒等生理活動(dòng)產(chǎn)生著重要的影響[11]。DA表達(dá)的降低會(huì)引起意志活動(dòng)的減少，情感淡漠等情志異常問(wèn)題，同時(shí)也會(huì)影響5-HT神經(jīng)能元及其通路，進(jìn)而引起抑郁的發(fā)生，NE亦是導(dǎo)致抑郁的一個(gè)重要介質(zhì)[12]。有研究表明[13-14]DA、NE與肝郁氣滯證關(guān)系十分密切?！毒霸廊珪D人規(guī)》載曰:“產(chǎn)育由于氣血，氣血由于情懷，情懷不暢，則沖任不充，沖任不充則胎孕不受?！敝嗅t(yī)學(xué)認(rèn)為情志與肝的關(guān)系最為密切，沖、任、督三脈皆起于胞宮而通于肝，故肝、沖任督脈、胞宮關(guān)系密切相關(guān)。正所謂“思慮無(wú)窮，皆難得子”，可見(jiàn)不良的情緒刺激，會(huì)產(chǎn)生惡性循環(huán)，加重不孕病情。因此對(duì)不孕婦女情志的調(diào)節(jié)是該病在治療過(guò)程中不可忽視的一部分。而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，NE、DA具有調(diào)節(jié)情緒的生理功能，并且DA是 NE 的前體，參與著心理應(yīng)激活動(dòng)以及精神情緒活動(dòng)，當(dāng)DA、NE表達(dá)異常時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)情緒的異常。在本研究中，病證結(jié)合組的 DA、NE含量較正常組明顯下降，提示模型大鼠存在肝郁氣滯，高、中劑量組的膈下逐瘀湯能夠明顯升高 DA、NE 含量，從而改善大鼠了“肝郁”狀態(tài)，這都客觀證實(shí)了GD具有疏肝行氣作用，可以改善大鼠的“氣滯血瘀”證候。另一方面，從組織病理學(xué)來(lái)看，慢性輸卵管炎的病理表現(xiàn)形式包括慢性間質(zhì)性輸卵管炎、輸卵管積水以及輸卵管積膿等，具體可見(jiàn)輸卵管壁間結(jié)締組織增生纖維化，管壁增厚或變硬，輸卵管及周邊組織黏連，輸卵管腔內(nèi)積水、積膿等[15]。久之，導(dǎo)致輸卵管纖維化，輸卵管僵硬變形，導(dǎo)致婦女不孕。因此，在本研究中，我們著重從光鏡、電鏡等不同角度觀察GD對(duì)模型大鼠輸卵管組織形態(tài)以及病理學(xué)方面的影響，更進(jìn)一步證實(shí)了GD的有效性。

綜上可見(jiàn)，GD通過(guò)改善模型大鼠中醫(yī)證候積分、血流變、DA與NE的表達(dá)、輸卵管病理表現(xiàn)及輸卵管組織形態(tài)，對(duì)氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕癥起到積極的治療作用。