王佳麗 陳嘉玲 陳光倩 彭 祺, 傅建偉

(1.紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，紹興黃酒研究院，浙江 紹興 312000;2.國家黃酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，浙江 紹興 312071;3.國家黃酒工程技術(shù)研究中心分中心，浙江 紹興 312000)

0 引言

1999年，原國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布了《原產(chǎn)地域產(chǎn)品保護規(guī)定》，標志著有中國特色的地理標志產(chǎn)品保護制度的初步確立.2000年，紹興酒成為中國第一個受到保護的地理標志產(chǎn)品，即地理標志保護產(chǎn)品.2005年7月15日起頒布實施的《地理標志產(chǎn)品保護規(guī)定》對地理標志產(chǎn)品實施了專門保護[1].地理標志產(chǎn)品由于其特殊的經(jīng)濟意義和商業(yè)價值，給使用者、使用地區(qū)帶來了競爭優(yōu)勢和經(jīng)濟財富，是其品牌建設(shè)和發(fā)展的重要砝碼，其保護價值愈發(fā)凸顯[2].但是國內(nèi)對地理標志產(chǎn)品的保護仍停留在健全法制的層面，對使用檢測手段來區(qū)分地理標志產(chǎn)品與非地理標志產(chǎn)品的研究并不多見.課題組分析借鑒了國內(nèi)外同行的研究經(jīng)驗[3-8]，結(jié)合紹興酒的實際，探索通過元素分析與多元統(tǒng)計分析方法結(jié)合建立指紋數(shù)據(jù)庫來鑒別和保護地理標志產(chǎn)品-紹興酒(GB/T17946).

黃酒產(chǎn)區(qū)眾多，主要產(chǎn)區(qū)有浙江、上海、江蘇，此外還有眾多邊緣產(chǎn)區(qū)，例如安徽、福建、山東等地，不同產(chǎn)區(qū)的黃酒在品質(zhì)上差別較大，即使是同一產(chǎn)區(qū)的黃酒，也存在較大差異.單就紹興黃酒就可分為地理標志產(chǎn)品-紹興酒(GB/T17946)和普通黃酒(GB/T13662). 地理標志產(chǎn)品-紹興酒(GB/T17946)[9]中對地理標志產(chǎn)品紹興酒的注釋是：以優(yōu)質(zhì)糯米、小麥和保護范圍內(nèi)的鑒湖水為主要原料，經(jīng)過獨特工藝發(fā)酵釀造而成的優(yōu)質(zhì)黃酒.其中的主要原料鑒湖水、糯米和小麥帶入的原料因素，產(chǎn)地的土壤、地質(zhì)、氣候等環(huán)境因素以及獨特工藝發(fā)酵釀造等人為因素，決定了產(chǎn)品的品質(zhì)及其特征和風(fēng)格口感[10].

黃酒成分復(fù)雜，除了水和酒精，還有大量的無機和有機成分，如糖、有機酸、酚類化合物、氨基酸、金屬元素等，所有這些化學(xué)物質(zhì)對酒的品質(zhì)、風(fēng)味和口感都有重要影響.研究指出許多微量元素的濃度在發(fā)酵過程和澄清過程中減少；如Li，B，Mg，Ca，Rb，Cs，Pb在黃酒精化過程中變得微量；在另一項研究中[11]，許多元素的含量如Al，Co，Cr，Cu，F(xiàn)e，Mn，Zn，Pb，V，Zn由于土壤凈化可能會受到影響.元素不僅是酒中的重要組成部分，還關(guān)系到風(fēng)味、口感和外觀.黃酒中元素主要來源于發(fā)酵的原料，通過酵母和其他微生物協(xié)同發(fā)酵，將糯米和小麥中的淀粉、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分解為低聚糖、多糖、氨基酸、二肽和其他成分.與此同時，原料中的元素釋放轉(zhuǎn)入發(fā)酵產(chǎn)物，最后轉(zhuǎn)移到成品酒.黃酒中元素的另一個重要來源是水.水不僅充當有機和無機物質(zhì)的溶劑，還是黃酒的主要成分.此外，元素也可以產(chǎn)生于釀酒過程中的器皿、設(shè)備儀器等.因此，黃酒原料、水源和釀造過程釀造工藝的不同都會導(dǎo)致元素組成的差異.

基于地理標志產(chǎn)品的多樣性和復(fù)雜性，元素是一個比較穩(wěn)定的因素，且元素的含量與產(chǎn)品產(chǎn)區(qū)生態(tài)、土壤等條件密切相關(guān)，在產(chǎn)品中具有相對穩(wěn)定的元素構(gòu)成比例.且元素的測定方法較成熟，樣品處理過程較簡單，耗時較少.測定元素常用方法有原子吸收光譜法(AAS)、原子發(fā)射光譜法(AES)、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)等[12-13].電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)儀器具有高效的樣品分析能力和極高的檢測靈敏度.ICP-MS以等離子體(ICP)作為離子源，通過質(zhì)譜(MS)分析器檢測產(chǎn)生的離子，可以同時測量元素周期表中大多數(shù)元素，測量分析物濃度可達到ng/L或萬億分之幾(ppt)的水平.用元素分析建立快速鑒別地理標志產(chǎn)品有廣泛應(yīng)用空間.本文通過探究產(chǎn)區(qū)間存在明顯差異的特征元素，利用專業(yè)分析方法來鑒別地理標志產(chǎn)品紹興酒(GB/T17946)和普通黃酒(GB/T13662).

1 材料與方法

1.1 樣品

本文根據(jù)水源和地域的不同，將研究對象分成三組：A組，地理標志產(chǎn)品紹興酒(GB/T17946)40個；B組，普通紹興黃酒(GB/T13662)40個；C組，非紹興產(chǎn)區(qū)的黃酒(GB/T13662)40個.其中112個是半干型黃酒，8個是干型黃酒.所有的樣品年份均為2014年，每個樣品及存放容器都排除了外部添加物.

1.2 樣品制備

1 mL酒樣置于聚四氟乙烯微波消化管內(nèi)，加入8 mL 68% (wt%)HNO3(優(yōu)級純)，2 mL 30% (wt%)過氧化氫(優(yōu)級純)，微波消解.消解程序見表1.微波消解后聚四氟乙烯微波消解罐置于加熱電爐上(設(shè)定在140 ℃)揮發(fā)多余的硝酸，用2%(wt%)的HNO3定容至25 mL，同時設(shè)置空白樣品.為防止污染，所有使用的器皿浸泡在20%(wt%)HNO3至少24 h，使用前用超純水洗凈.

表1 微波消解中的加熱程序

1.3 儀器與試劑

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀7500a(美國安捷倫儀器有限公司)，儀器條件參數(shù)見表2；微波消解系統(tǒng) MARS 6型(美國CEM公司)；超純水：電阻率18.2 MΩ/cm(美國 Millipore 公司)；硝酸(優(yōu)級純)：美國Sigma-Aldrich公司；30% (wt%) 過氧化氫(優(yōu)級純)：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；混合標準儲備液(國家標準物質(zhì)研究中心)：K、Na、Ca、Mg、Fe(C=1.0 g/L)，Mn、Cu、Zn、Cr、Pb、Cd、Ba、Ni、Al、As(C=0.01 g/L)；混合標準使用液(國家標準物質(zhì)研究中心)：K、Na、Ca、Mg、Fe(C=0.1 g/L)，Mn、Cu、Zn、Cr、Pb、Cd、Ba、Ni、Al、As(C=1.0 mg/L)；質(zhì)譜調(diào)諧液(國家標準物質(zhì)研究中心)： Li、Y、Ce、Tl、Co(C=10 μg/L)；內(nèi)標溶液(國家標準物質(zhì)研究中心)：Sc、Ge、In、Bi(C=0.01 g/L)，使用前用1% (wt%)的HNO3稀釋為C=1 μg/L.

表2 檢測時ICP-MS的條件參數(shù)

1.4 統(tǒng)計分析

方差分析(Analysis Of Variance，ANOVA)，是用于多個樣本均數(shù)差別的顯著性檢驗.從觀測變量的方差入手，研究多個控制變量中哪些變量是對最終研究對象有顯著影響的變量.分析時排除一些極端的離群值.計算檢查F值，篩選出研究對象中有統(tǒng)計意義的明顯差異變量.

主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，是一種掌握事物主要矛盾的統(tǒng)計分析方法，在力保數(shù)據(jù)丟失最少的原則下，對多變量的數(shù)據(jù)進行最優(yōu)綜合性精簡，對高維的變量進行降維處理，從多元事物中解析出主要影響因素，簡化復(fù)雜問題，揭示事物本質(zhì)[14-15].

線性判別分析(Linear Discriminant Analysis，LDA)，是將高維的模式樣本投影到最佳鑒別矢量空間，達到分類數(shù)據(jù)信息和降低特征空間維度的效果，模式在最終空間內(nèi)達到最佳分離性，是一種有效的特征抽取方法[16].

偏最小二乘法-判別分析(Partial Least Squares-Discriiminate Analysis，PLS-DA)，是一種對多組變量進行建模的多元統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析方法.它既是一種特征抽取方法，又是一種回歸分析模型.通過抽取潛在信息，對包含多因變量的數(shù)據(jù)進行建模分析[17-18].

2 結(jié)果與討論

2.1 微量元素數(shù)據(jù)分析

對三組黃酒樣品中16種微量元素(Na，Mg，Al，Cr，As，Cd，Pb，K，Ca，Mn，Ni，Cu，Zn，F(xiàn)e，Se，Ba)進行測定，含量見表3，測定結(jié)果進行方差分析，結(jié)果顯示三組樣品中Mg，K，Ca，Mn，Zn，F(xiàn)e這6種元素的含量有明顯差異，A組紹興酒中Mg，K，Ca，Mn，Zn元素含量明顯高于B組和C組.

2.2 主成分分析(PCA)結(jié)果

對不同組別的黃酒元素數(shù)據(jù)進行PCA分析，獲得較為直觀的結(jié)果(圖1)，除個別酒樣存在離群外，將A組、B組和C組有效的劃分，可以初步區(qū)分地理標志產(chǎn)品紹興酒(GB/T17946)和非地理標志產(chǎn)品黃酒(GB/T13662).同時主成分分析獲得的結(jié)果只是初步的，需要利用LDA和PLS-DA分析進一步提高分離度.

表3 紹興酒與普通紹興黃酒及非紹興產(chǎn)區(qū)黃酒中16種元素的含量

圖1三組黃酒樣品PCA分析(a)和PLS-DA分析(b)結(jié)果圖

2.3 LDA和PLS-DA分類結(jié)果

利用LDA和PLS-DA來分類樣品和構(gòu)建模型[17-18]，其中81個(A、B、C組各27個)為校準樣本集，39個(A、B、C組各13個)為預(yù)測樣本集.校準樣本集和預(yù)測樣本集的樣品均為隨機選取.通過LDA和PLS-DA進行數(shù)據(jù)處理分析，分離不同組別的樣品，構(gòu)建模型. 結(jié)果如表4，僅有2個樣品出現(xiàn)偏差，準確率高達94.9%.圖1(b)是在PCA分析處理的基礎(chǔ)上，利用PLS-DA分析處理達到高度分離的結(jié)果，將3個組別的樣品清晰地劃分.

表4 利用LDA和PLS-DA分析區(qū)分3個組別黃酒

3 結(jié)論

本文通過微量元素組成測定，結(jié)合方差分析和主成分分析不同組別樣品間的內(nèi)部差異，利用線性判別分析(LDA)和偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)分類和建立模型，實現(xiàn)利用黃酒中微量元素的指紋識別來區(qū)別不同產(chǎn)區(qū)黃酒，正確率高達100%和94.9%.不同產(chǎn)區(qū)黃酒差異的主要因素為原材料(主要是釀造水)和釀造工藝.總體來說，可以得出結(jié)論：微量元素指紋識別可以作為有效工具來區(qū)別和保護地理標志產(chǎn)品-紹興酒.然而，這只是一個可行性研究.在進一步研究中還需擴大樣品的采集數(shù)量，分類建立不同酒廠的元素數(shù)據(jù)庫，建立模型，不斷擴充和更新數(shù)據(jù)庫，為保護地理標志產(chǎn)品-紹興酒，提供科學(xué)、快速的鑒定檢測方法.