申 潔 王玉國 郭平毅 原向陽

（1長(zhǎng)治學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，046011，山西長(zhǎng)治；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，030801，山西太谷）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因干旱導(dǎo)致的糧食減產(chǎn)占減產(chǎn)總量的50%以上，干旱成為影響糧食作物生長(zhǎng)、產(chǎn)量及分布的最主要非生物脅迫之一[1-2]。谷子[Setariaitalica(L.) Beauv.]被譽(yù)為“五谷之首”，營養(yǎng)價(jià)值高，是我國北方旱作農(nóng)業(yè)的主要糧食作物之一[3]。谷子具有基因組小、生長(zhǎng)周期短及耐瘠耐旱性強(qiáng)等特點(diǎn)，是禾本科作物抗性機(jī)理研究的模式植物[4]。谷子雖然耐旱，但干旱仍然是制約其發(fā)展的重要因素之一。

近年來，應(yīng)用外源物質(zhì)緩解或減輕植物干旱脅迫已成為植物抗旱性研究的熱點(diǎn)。腐植酸（humic acid，HA）是一類成分復(fù)雜的天然有機(jī)物，能通過根、莖和葉進(jìn)入植物體，可提高植物光合作用，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育[5]，改善形態(tài)生理特征，在緩解多種逆境對(duì)作物的脅迫中發(fā)揮重要作用[6-8]。因此，研究腐植酸對(duì)干旱脅迫下谷子幼苗葉片抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（ascorbate-glutathione cycle，AsA-GSH）的影響對(duì)探索提高谷子抗旱的途徑具有重要意義。

腐植酸可通過控制植物體內(nèi)活性氧類物質(zhì)的含量來協(xié)助植物抵御逆境脅迫[9]。適宜濃度的黃腐酸鉀可提高玉米細(xì)胞保護(hù)酶含量，降低丙二醛含量和膜脂過氧化程度，增加膜的穩(wěn)定性，提高植物抗旱性[10]。李英浩等[11]研究表明，腐植酸可緩解干旱脅迫對(duì)燕麥光合系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）光反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的傷害。關(guān)于腐植酸緩解谷子干旱脅迫的研究表明，腐植酸主要通過保持植物體內(nèi)水分含量及提高PSⅡ和光合系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）的實(shí)際光化學(xué)速率來促進(jìn)光合作用，誘導(dǎo)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)產(chǎn)生，提高抗氧化系統(tǒng)的作用，以提高谷子抗旱性，降低干旱對(duì)質(zhì)膜的損傷，從而有效緩解干旱脅迫對(duì)谷子的傷害[12]。AsA-GSH是植物清除活性氧（ROS）的酶促系統(tǒng)，在植物抵抗逆境脅迫方面發(fā)揮著重要作用[13]。目前，腐植酸在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但針對(duì)谷子方面的研究較少，腐植酸能否調(diào)控干旱脅迫下AsAGSH循環(huán)代謝，從而緩解干旱脅迫帶來的損傷，目前尚不明確。本試驗(yàn)研究腐植酸對(duì)干旱脅迫下谷子幼苗葉片AsA-GSH循環(huán)中抗氧化物質(zhì)及相關(guān)代謝酶活性的影響，探討干旱脅迫下腐植酸調(diào)控AsAGSH循環(huán)代謝的機(jī)理，旨在為緩解干旱脅迫對(duì)植物的傷害提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

供試谷子品種為普通優(yōu)質(zhì)谷子晉谷21號(hào)（由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供）和雜交高產(chǎn)谷子張雜10號(hào)（由河北省張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供）。

腐植酸（C9H9NO6）分子量227.17，由山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司生產(chǎn)；泥炭土有機(jī)基質(zhì)由丹麥品氏托普（集團(tuán)）公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年6-8月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)除草與化學(xué)調(diào)控實(shí)驗(yàn)室及露天天臺(tái)進(jìn)行。設(shè)置腐植酸處理濃度0、50、100、200和300mg/L（分別用T0、T1、T2、T3和T4表示），進(jìn)行干旱脅迫，用不同濃度HA浸種12h，以蒸餾水浸種、不進(jìn)行干旱脅迫為對(duì)照（CK）。浸種結(jié)束后，將種子置于濾紙上自然風(fēng)干。

采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，將浸種后的晉谷21號(hào)和張雜10號(hào)均勻播種于裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽（13cm×15cm）中，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于露天天臺(tái)上自然生長(zhǎng)，并用遮陽網(wǎng)進(jìn)行50%遮陰保護(hù)。種子萌發(fā)后，每盆定植6株，每天正常澆水以確保幼苗正常生長(zhǎng)，待幼苗長(zhǎng)至3～5葉期時(shí)停止?jié)菜–K正常澆水），進(jìn)行干旱脅迫處理（自然干旱），脅迫10d后測(cè)定各指標(biāo)。利用土壤水分測(cè)定儀TDR300（Spectrum，美國）測(cè)定干旱10d的基質(zhì)含水量，為19.30%。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

參照Nakano等[14]的方法測(cè)定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性；參照金夢(mèng)陽等[15]的方法測(cè)定谷胱甘肽還原酶（GR）活性；參照Hoque等[16]的方法測(cè)定單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性；參照Doulis等[17]的方法測(cè)定脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性；參照J(rèn)iang等[18]的方法測(cè)定還原型抗壞血酸（AsA）和氧化型抗壞血酸（DHA）含量；參照Nagalakshmi等[19]的方法測(cè)定還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，采用DPS 6.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（α=0.05），圖表中數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐植酸對(duì)干旱脅迫下谷子幼苗葉片AsA-GSH循環(huán)相關(guān)代謝酶活性的影響

由圖1可知，干旱脅迫顯著提高了晉谷21號(hào)幼苗葉片的APX、GR、MDHAR和DHAR活性，其中張雜10號(hào)的APX和DHAR活性分別較CK顯著提高9.45%和10.12%，而MDHAR活性與CK相比無顯著差異。隨著HA濃度的增加，2個(gè)品種的APX、GR、MDHAR和DHAR活性均呈先升高后降低的趨勢(shì)，T2處理的酶活性最強(qiáng)，張雜10號(hào)葉片T2處理的APX活性較T0增加了12.61%，差異顯著；HA處理顯著提高了2個(gè)品種的DHAR活性，其中晉谷21號(hào)和張雜10號(hào)T2處理分別較T0提高了15.20%和16.19%。這表明適宜濃度的HA處理可提高谷子幼苗抗氧化酶活性，可有效緩解了干旱脅迫對(duì)谷子的傷害。

圖1 腐植酸對(duì)干旱脅迫下谷子幼苗葉片APX、GR、MDHAR和DHAR活性的影響Fig.1 Effects of HA on APX, GR, MDHAR and DHAR activities in foxtail millet seedling leaves

2.2 腐植酸對(duì)干旱脅迫下谷子幼苗葉片抗壞血酸含量的影響

由表1可知，干旱脅迫顯著提高了晉谷21號(hào)和張雜10號(hào)谷子幼苗葉片的還原型抗壞血酸（AsA）和總抗壞血酸（T-AsA）含量，其中AsA含量分別較CK增加了1.12和1.03倍，T-AsA含量分別增加了24.74%和44.65%。隨著HA濃度的提高，2個(gè)品種的AsA和T-AsA含量基本呈先升高后降低的趨勢(shì)，晉谷21號(hào)的AsA含量在T3處理時(shí)最高，較T0顯著增加了14.84%，T-AsA含量在T2處理時(shí)最高，較T0顯著增加了16.31%；張雜10號(hào)的AsA和T-AsA含量均在T2處理時(shí)最高，分別較T0顯著增加了33.00%和17.27%。干旱脅迫下，HA對(duì)晉谷21號(hào)和張雜10號(hào)幼苗葉片DHA含量的影響相對(duì)較小，分別在T2和T3處理時(shí)DHA含量最高。

干旱脅迫下，谷子幼苗葉片AsA/DHA值顯著增加，2個(gè)品種分別較CK增加了1.65和0.91倍。適宜濃度的腐植酸可提高AsA/DHA值，晉谷21號(hào)在T3處理時(shí)較T0顯著增加了29.49%，張雜10號(hào)在T2處理時(shí)較T0增加了36.28%，且差異均顯著（表 1）。

表1 腐植酸對(duì)干旱脅迫下谷子幼苗抗壞血酸含量的影響Table 1 Effects of HA on ascorbic acid contents in the seedlings of foxtail millet under drought stress nmol/μg FW

2.3 腐植酸對(duì)干旱脅迫下谷子幼苗葉片谷胱甘肽含量的影響

由表2可知，干旱脅迫下，晉谷21號(hào)和張雜10號(hào)谷子幼苗葉片GSH、GSSH和總谷胱甘肽（T-GSH）含量較CK均顯著增加。隨著HA濃度的增加，GSH和T-GSH含量出現(xiàn)上升的趨勢(shì)，晉谷21號(hào)在T2處理下含量最高，GSH和T-GSH分別較T0增加1.35%和1.14%，且差異顯著；張雜10號(hào)的GSH和T-GSH含量分別在T3和T2處理下最高，分別較T0顯著增加1.38%和1.04%，隨后開始下降，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而HA處理下谷子幼苗葉片GSSG含量較T0無顯著差異（除了張雜10號(hào)T3處理）。

表2 腐植酸對(duì)干旱脅迫下谷子幼苗谷胱甘肽含量的影響Table 2 Effects of HA on glutathione contents in the seedlings of foxtail millet under drought stress nmol/mg FW

干旱脅迫下2個(gè)品種的GSH/GSSG值較CK顯著降低，隨著HA濃度的增加，GSH/GSSG值基本呈先上升后下降的趨勢(shì)，2個(gè)品種的GSH/GSSG值均在T3處理時(shí)最大，分別較T0增加2.27%和7.14%，其中張雜10號(hào)差異達(dá)顯著水平（表2）。

3 討論

干旱使植物體內(nèi)積累大量的O1、O2·、H2O2和·OH等活性氧（ROS）物質(zhì)，造成膜脂過氧化，而植物為適應(yīng)環(huán)境的改變，在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中形成了抵抗ROS氧化毒害的抗氧化系統(tǒng)，精準(zhǔn)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的ROS代謝，從而維持或重建氧化還原平衡[20-21]。

AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)作為植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要機(jī)制，是清除ROS的重要途徑。APX、GR、MDHAR和DHAR是AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，對(duì)循環(huán)系統(tǒng)中抗氧化物質(zhì)AsA和GSH的再生及循環(huán)的有效運(yùn)轉(zhuǎn)具有重要作用[22]。研究表明，HA可促進(jìn)干旱脅迫下玉米[10]和甘蔗[23]活性氧的早期積累，并有效激活保護(hù)酶超氧化物歧化酶、過氧化物酶、APX和GR的活性。本研究中，干旱脅迫提高了晉谷21號(hào)和張雜10號(hào)的APX、GR、MDHAR和DHAR活性，這與董守坤等[24]的研究結(jié)果一致，雜交谷清除活性氧能力顯著高于常規(guī)谷，說明雜交谷具有較強(qiáng)的抗旱性，充分體現(xiàn)了雜種優(yōu)勢(shì)。HA提高了谷子APX、GR、MDHAR和DHAR活性，尤其對(duì)APX和DHAR活性作用更明顯，表明適宜濃度的HA處理可提高谷子幼苗AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)酶活性，從而促進(jìn)干旱脅迫下谷子幼苗AsA-GSH循環(huán)的有效運(yùn)轉(zhuǎn)，緩解干旱脅迫對(duì)谷子的傷害。

AsA和GSH是AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中主要的抗氧化物質(zhì)，可抵御植物細(xì)胞活性氧造成的氧化脅迫[25]，維持體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)[26]。AsA和GSH含量及其氧化還原狀態(tài)的改變是植物應(yīng)對(duì)脅迫的一種生理性調(diào)節(jié)[27]，AsA、GSH含量及AsA/DHA、GSH/GSSH值的提高可維持細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡，從而減緩脅迫對(duì)植物造成的傷害[28]。本研究表明，干旱脅迫可顯著提高谷子幼苗葉片中AsA、T-AsA、GSH、T-GSH含量及AsA/DHA值，降低GSH/GSSH值，這與鄭清嶺等[29]的研究結(jié)果一致。通過添加外源物質(zhì)可提高抗氧化物質(zhì)含量，從而緩解膜脂過氧化，本研究表明，腐植酸顯著提高了谷子葉片AsA、T-AsA、GSH、T-GSH含量以及AsA/DHA值，減緩了GSH/GSSH值的降低，使GSH/GSSH值升高，這與外源物質(zhì)減輕秋茄[30]和茶樹[31]逆境脅迫傷害的研究結(jié)果一致。但也有研究表明外源物質(zhì)可抑制逆境脅迫下AsA和GSH含量的升高[32]，這可能與逆境脅迫類型、脅迫強(qiáng)度（時(shí)間長(zhǎng)短）和試驗(yàn)材料等有關(guān)。本課題組前期研究表明，HA緩解和清除了干旱脅迫導(dǎo)致的ROS積累[12]，這可能由于HA提高了AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)酶活性、抗氧化物質(zhì)含量以及提高了AsA/DHA和GSH/GSSH值，從而使AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)有效運(yùn)轉(zhuǎn)，這與劉建新等[22]研究外源物質(zhì)緩解燕麥逆境脅迫的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

HA可提高干旱脅迫下APX、GR、MDHAR和DHAR活性，促進(jìn)抗氧化物質(zhì)AsA和GSH再生，使AsA/DHA和GSH/GSSH值增加，從而有效清除干旱脅迫引起的ROS積累，降低干旱脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜的氧化損傷，有效緩解干旱脅迫對(duì)谷子幼苗生長(zhǎng)的傷害。