楊青茹，王華，周松峰，申紅星

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 南通 226019)

胃癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致死亡的第二大主要原因[1]。胃癌的致病因素很多，如EB病毒感染、幽門螺桿菌感染等[2]。胃癌的發(fā)生不僅影響蛋白代謝異常[3]，也涉及微小RNA(microRNA，miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和環(huán)狀RNA(circluar RNA， circRNA)等非編碼RNA的異常表達(dá)。CircRNAs自2013年發(fā)現(xiàn)其生物學(xué)功能以來(lái)，逐漸成為研究的熱點(diǎn)，研究顯示circRNAs參與癌癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[4]。CircRNAs分子是一類不具有5′末端帽子和3′末端poly(A)尾巴，并通過(guò)共價(jià)鍵形成環(huán)形的非編碼RNA分子，具有一定的組織、時(shí)序和疾病特異性，并發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)水平等方面的生物學(xué)功能[5-6]。已有研究表明，circ-HuR異位表達(dá)在體內(nèi)外均能抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。部分circRNAs分子含miRNAs應(yīng)答元件(miRNA response element，MRE)，可充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，與miRNAs結(jié)合，發(fā)揮miRNAs海綿的作用，上調(diào)靶基因表達(dá)水平；也可以翻譯成蛋白質(zhì)來(lái)發(fā)揮作用[8]。CeRNA調(diào)控在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如circRNA_LARP4通過(guò)抑制miR-424-5p和調(diào)控LATS1的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[9]；circPDSS1通過(guò)海綿miR-186-5p和調(diào)節(jié)NEK2促進(jìn)胃癌進(jìn)展[10]；circRNA_100782通過(guò)海綿吸附miR-574-3p，抑制Rb表達(dá)，促進(jìn)胃癌的增殖和轉(zhuǎn)移[11]。

雖然多個(gè)報(bào)道顯示circRNAs參與調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展，但是非編碼RNA尤其是circRNAs和miRNAs在胃癌中的詳細(xì)作用機(jī)制依然不清楚。本研究通過(guò)分析胃癌相關(guān)的多個(gè)circRNAs的測(cè)序數(shù)據(jù)，旨在揭示circRNAs-miRNAs-mRNAs網(wǎng)絡(luò)通過(guò)生物進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)方面參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 差異表達(dá)circRNAs的獲得

使用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)和在線分析工具R語(yǔ)言分析(http://www.dooccn.com/r/)GSE100170、GPL19978(GSE83521和GSE89143)、GSE78092和STAD(未上傳)數(shù)據(jù)庫(kù)中差異表達(dá)的circRNAs。

1.2 篩選circRNAs靶向的miRNAs及其驗(yàn)證

使用Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//bioinfo.au.tsinghua.edu.cn/software-database)預(yù)測(cè)circRNAs的靶向miRNAs，根據(jù)CLIP-Data≥2的篩選條件，篩選circRNAs下游的miRNAs，并利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(GSE23734)作為下游miRNAs準(zhǔn)確性的驗(yàn)證，其結(jié)果以韋恩圖呈現(xiàn)(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)。

1.3 篩選miRNAs靶向的mRNAs

使用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.TargetScan.org)預(yù)測(cè)miRNAs下游的mRNAs，其篩選標(biāo)準(zhǔn)為Total context+ score≤-0.75。

1.4 GO分析、KEGG分析和ceRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)

基因本體論(gene ontology，GO)分析包括生物進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)方面[12]。通過(guò)GO分析和KEGG分析驗(yàn)證mRNAs的功能。通過(guò)Cytoscape2.0軟件(http：//www.cytoscape.org)分析circRNAs-miRNAs-mRNAs三者之間的相互作用關(guān)系。

1.5 靶基因相關(guān)疾病

利用比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(The comparative toxicogenomics database)分析靶基因?qū)е碌南嚓P(guān)性疾病，網(wǎng)址為https://ctdbase.org/，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05[13]。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)測(cè)差異表達(dá)circRNAs的下游靶miRNAs以及驗(yàn)證

本文所使用的數(shù)據(jù)庫(kù)以及篩選流程圖如圖1所示。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)以及STAD中總共獲得了83 748個(gè)circRNAs，按照Log2(fold change，F(xiàn)C)>1，P<0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn)獲得734個(gè)差異表達(dá)的circRNAs(表1)。將circRNAs注釋后，利用韋恩網(wǎng)站處理，共獲得59個(gè)基因(表2)，其韋恩圖如圖2A所示。排除各種因素(沒(méi)有針對(duì)性的miRNAs，并且無(wú)法同時(shí)在兩個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中找到)發(fā)現(xiàn)17個(gè)差異表達(dá)的circRNAs，見(jiàn)表3。用Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)17個(gè)circRNAs的下游靶miRNAs，得到 354個(gè)miRNAs。以GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)集GSE23739 (共80對(duì)標(biāo)本，癌組和癌旁組各占一半)作為參考，進(jìn)一步驗(yàn)證354個(gè)miRNAs與胃癌的關(guān)系。根據(jù)P<0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn)，從GSE23739數(shù)據(jù)庫(kù)獲得512個(gè)miRNAs，并與預(yù)測(cè)到的354個(gè)miRNAs作韋恩圖(圖2B)，獲得46個(gè)共同的miRNAs(表4)。由于miR-483-3p沒(méi)有查詢到靶基因，最終選取45個(gè)miRNAs用于下一步分析。為驗(yàn)證癌組和癌旁組中差異性表達(dá)的circRNAs，用R語(yǔ)言作為運(yùn)行程序繪制熱圖。結(jié)果如圖2所示，分別顯示4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)GPL19978(圖2C)、GSE78092(圖2D)、GSE100170(圖2E)和STAD(圖2F)的circRNAs的差異表達(dá)。

圖1 差異表達(dá)circRNAs篩選技術(shù)路線圖

A：4個(gè)基因芯片數(shù)據(jù)(GSE78092，GSE100170，GPL19978，STAD)的韋恩圖；B：GSE23739和預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)的交集，篩選出46個(gè)miRNAs；C：GPL19978(癌組與癌旁組的比例為8 ∶9)；D：GSE78092(癌組與癌旁組的比例為3 ∶3)；E：GSE100170(癌組與癌旁組的比例為5 ∶5)；F：STAD(癌組與癌旁組比例為6 ∶6)圖2 差異表達(dá)circRNAs的篩選韋恩圖以及所選數(shù)據(jù)庫(kù)差異表達(dá)circRNAs的熱圖

表1 有關(guān)數(shù)據(jù)源的特定信息

表3 差異表達(dá)的circRNAs的P值以及倍數(shù)變化的對(duì)數(shù)值

表4 CircRNAs靶向的經(jīng)過(guò)篩選的下游miRNAs

2.2 靶基因的GO分析、KEGG分析以及ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控

利用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)，在Total context+score≤-0.75的篩選條件下，篩選出miRNAs下游的靶基因有1 040個(gè)。利用Cytoscape 2.0軟件將本研究所分析的17個(gè)circRNAs、45個(gè)miRNAs以及1 040個(gè)靶基因進(jìn)行ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分析(圖3A)，結(jié)果表明，某些miRNAs(hsa-miR-28-5p和hsa-miR-331-3p)可以結(jié)合多個(gè)circRNAs，說(shuō)明其在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮核心調(diào)節(jié)作用。通過(guò)GO分析研究核心miRNAs相對(duì)應(yīng)的靶基因，結(jié)果表明其主要在蛋白質(zhì)泛素化，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移、定位，病毒的轉(zhuǎn)移以及tRNA的核輸出等生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮作用(圖3B)。為進(jìn)一步研究circRNAs與胃癌的相關(guān)性，通過(guò)KEGG分析深入研究circRNAs相關(guān)靶基因的富集通路，由圖3C可見(jiàn)，其富集通路的途徑主要是通過(guò)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)中的SNARE相互作用(hsa04130)、氧化磷酸化(hsa00190)、MAPK信號(hào)通路(hsa04010)和N-糖基生物合成(hsa00510)來(lái)實(shí)現(xiàn)。而調(diào)控轉(zhuǎn)錄的生物過(guò)程主要是轉(zhuǎn)錄RNA代謝、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)和蛋白質(zhì)定位。

A：用Cytoscape2.0軟件分析circRNAs-miRNAs-mRNAs的ceRNA關(guān)系，紅色：circRNAs，綠色：miRNAs，藍(lán)色：mRNAs； B：GO分析，紅色：生物進(jìn)程，綠色：細(xì)胞組分，藍(lán)色：分子功能；C：靶基因的KEGG分析圖3 靶基因的互作網(wǎng)絡(luò)圖以及靶基因GO分析和KEGG分析

由表5可見(jiàn)，miRNAs下游富集的核心基因相關(guān)的疾病包括腫瘤、組織學(xué)類型的腫瘤、腺癌、皮膚和結(jié)締組織疾病、白血病和急性骨髓白血病等，而與其相關(guān)程度最大的疾病仍是腫瘤，為我們研究胃癌提供了許多參考依據(jù)。CircRNAs在腫瘤中的作用機(jī)制研究較多，其中胃癌內(nèi)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制為本課題組的研究重點(diǎn)，為后續(xù)研究胃癌相關(guān)的circRNAs、miRNAs以及mRNAs奠定了基礎(chǔ)。

表5 核心基因相關(guān)疾病 (前10個(gè))

3 討論

本研究利用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)胃癌差異表達(dá)的circRNAs(如hsa_circ_0092342、hsa_circ_0054970和hsa_circ_0084909)可作為胃癌診斷標(biāo)志物以及發(fā)揮ceRNA調(diào)控作用，影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。結(jié)果表明，hsa_circ_0092342可通過(guò)hsa-miR-654-3p靶向CLVS1/PGBD1發(fā)揮促進(jìn)或抑制胃癌的作用；hsa_circ_0054970可通過(guò)hsa-miR-525-5p靶向TMEM65對(duì)胃癌發(fā)揮作用。KEGG分析結(jié)果表明，靶基因發(fā)揮的主要作用是轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA代謝過(guò)程、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)和蛋白質(zhì)定位等。此項(xiàng)研究的意義是發(fā)現(xiàn)差異circRNAs表達(dá)以及ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的變化，尤其是差異表達(dá)特別明顯的幾個(gè)circRNAs對(duì)胃癌的診斷作用。目前為止，研究者已發(fā)現(xiàn)胃癌的各種生物標(biāo)志物，例如腦表達(dá)X連鎖4( brain-expressed X-linked 4 ，BEX4)，煙酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶等[14-15]。多項(xiàng)研究已證實(shí)ceRNA調(diào)控機(jī)制，如circRNA_100269在胃癌中下調(diào)，并通過(guò)靶向miR-630抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；circRNA_001569通過(guò)吸附miR-145在胃癌中促進(jìn)細(xì)胞增殖；干擾circRNA_0001947表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[16-18]。在胃癌組織中發(fā)現(xiàn)大量的miRNAs，高表達(dá)miR-125b-5p的胃癌患者生存期明顯縮短，證明miR-125b-5p能促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展[19]。本研究中的核心miRNAs為miR-28-5p和miR-331-3p，其中miR-28-5p在胃癌中尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，但在鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)其影響鼻咽癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲[20]；而miR-331-3p在許多癌癥研究中都有報(bào)道，如circCACTIN通過(guò)吸附miR-331-3p和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體1(TGFBR1)的表達(dá)促進(jìn)胃癌進(jìn)展[21]，circ_0038646通過(guò)miR-331-3p/GRIK3促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移[22]。

在胃癌中已發(fā)現(xiàn)許多circRNAs，部分存在于真核細(xì)胞的胞質(zhì)中，少部分內(nèi)含子來(lái)源的circRNAs存在于細(xì)胞核內(nèi)。若circRNAs主要存在胞質(zhì)中，則作為miRNAs海綿發(fā)揮作用，進(jìn)而解除miRNAs對(duì)其靶基因的抑制作用；若定位于細(xì)胞核內(nèi)，則可充當(dāng)RNA結(jié)合蛋白發(fā)揮作用[23]。就目前的研究而言，多數(shù)circRNAs主要是通過(guò)ceRNA調(diào)控機(jī)制促進(jìn)或者抑制胃癌的增殖和遷移，但還有很多尚未知悉的生物學(xué)功能，其在疾病診斷治療的研究還不深入，需要進(jìn)一步求證。今后應(yīng)深入研究circRNAs在胃癌診斷、治療方面的作用機(jī)制，充分了解其生物學(xué)功能，使其能更廣泛地應(yīng)用于研究領(lǐng)域。