呂楊波，邱丹，龔江，徐天生，林水泉

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬衢州醫(yī)院/浙江省衢州市人民醫(yī)院 肛腸外科，浙江 衢州 324000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球發(fā)病率排名第三、病死率排名第二的惡性腫瘤[1]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是CRC最常見(jiàn)的侵襲方式[2]，也是預(yù)測(cè)和決定患者預(yù)后的關(guān)鍵因素[3]。然而，CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子通路尚不明確，這制約了CRC侵襲機(jī)制的研究，也限制了針對(duì)性的臨床治療。以往的研究證實(shí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程復(fù)雜，多種離子通道及膜受體蛋白參與其中[4]。

電壓門(mén)控鈉通道（volt age-gated sodium channels，VGSC，Nav）是鑲嵌于細(xì)胞膜上的大分子蛋白復(fù)合物。Nav亞基已被證實(shí)在多種癌細(xì)胞中異常高表達(dá)，并促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲。如Nav1.7α亞基通過(guò)MACC1介導(dǎo)的NHE1上調(diào)促進(jìn)胃癌進(jìn)展[5]。Nav1.5α亞基的表達(dá)與乳腺癌[6]、非小細(xì)胞肺癌[7]、卵巢癌[8]、前列腺癌[9]等癌癥的侵襲性密切相關(guān)，它還通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)、類(lèi)固醇代謝進(jìn)程和細(xì)胞周期控制蛋白的表達(dá)，來(lái)促進(jìn)CRC的轉(zhuǎn)移[10-11]。然而迄今為止，Nav與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚不明確。本研究對(duì)Nav與CRC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性進(jìn)行初步探討，為今后深入研究CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本收集

臨床評(píng)估無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的首發(fā)CRC患者經(jīng)腹腔鏡腸癌根治術(shù)后，標(biāo)本離體第一時(shí)間取樣，切取腫瘤病灶約0.5 cm×0.5 cm作為腫瘤組織；在距腫瘤邊緣5 cm以上腸壁組織（黏膜及黏膜下層）切取0.5 cm×0.5 cm作為癌旁組織進(jìn)行對(duì)照[2]，在 2 min內(nèi)放置入-80 ℃冰箱冷凍。腫瘤根治標(biāo)本經(jīng)病理確診為CRC后，其病例資料錄入數(shù)據(jù)庫(kù)。所有入組患者均簽署樣本采集及使用知情同意書(shū)，該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)號(hào)：2019（001）。

1.2 qRT-PCR 檢測(cè)各Nav 亞型表達(dá)水平

標(biāo)本的qRT-PCR檢測(cè)方案參考王磊等[12]的工作進(jìn)行改進(jìn)。按照說(shuō)明書(shū)中的方法，使用TRIzol試劑（Invitrogen）對(duì)100例CRC患者的腫瘤組織和癌旁組織的總RNA進(jìn)行制備。然后，采用Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，美國(guó)）將RNA（1 μg）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix kit（Fermentas，美國(guó)）在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR。所得數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt相對(duì)定量法進(jìn)行分析。以患者癌旁組織中表達(dá)量為參考，分析各Nav亞型表達(dá)水平。引物要求：用NCBI primer blast設(shè)計(jì)，產(chǎn)物長(zhǎng)度：100～200 bp，退火溫度57～60 ℃。引物序列和相應(yīng)的基因見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 HE 染色的免疫組織化學(xué)分析

為了確保本研究所切取的腫瘤組織和癌旁組織對(duì)照準(zhǔn)確無(wú)誤，在大體病理標(biāo)本確診的情況下，課題組隨機(jī)挑選了3例患者的直腸癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行HE染色。方案參考唐偉森等[13]的工作進(jìn)行，腫瘤大體標(biāo)本經(jīng)3.7%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚度切片行HE染色。免疫組化步驟如下：石蠟切片脫蠟、水化后PBS沖洗，EDTA高壓加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，HRP阻斷劑封閉內(nèi)源過(guò)氧化酶活性。一抗37 ℃孵育1 h，加HRP標(biāo)記的二抗37 ℃孵育30 min后，清洗3遍。DAB顯色液顯色約5 min，蘇木素復(fù)染，脫水，封片，鏡檢，拍照。

1.4 分組與分析

統(tǒng)計(jì)各入組患者的臨床病理因素。將CRC腫瘤組織與癌旁組織內(nèi)各Nav的表達(dá)進(jìn)行對(duì)比，以腫瘤組織中表達(dá)量與癌旁組織中表達(dá)量的比值進(jìn)行描述，比值2以上為高表達(dá)，描述其高表達(dá)患者所占比例。根據(jù)所有患者腫瘤根治標(biāo)本中的淋巴結(jié)病理結(jié)果，按是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為淋巴結(jié)陽(yáng)性組和淋巴結(jié)陰性組，統(tǒng)計(jì)兩組間各Nav表達(dá)的差異，篩選出存在差異的Nav，進(jìn)行分析。分析Nav的表達(dá)與脈管內(nèi)癌栓及神經(jīng)累犯的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件中的t檢驗(yàn)及相關(guān)性分析中雙因素相關(guān)的Spearman檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 患者臨床病理因素統(tǒng)計(jì)

對(duì)入組100例患者的臨床病理信息進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，患者平均年齡（59.3±11.6）歲；結(jié)腸癌67例，直腸癌33例；淋巴結(jié)檢出數(shù)為（21.1±6.4）枚， 淋巴結(jié)陽(yáng)性者占37.0%，患者的陽(yáng)性淋巴結(jié)總數(shù)平均為（1.0±1.7）枚?；颊咂渌Y料見(jiàn)表2。

表2 CRC 患者的臨床病理資料[n（%）]Table 2 The clinicopathologic data of the CRC patients [n (%)]

2.2 CRC 標(biāo)本的HE 染色分析

對(duì)3例患者的直腸癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行HE染色后可見(jiàn)腫瘤組織內(nèi)見(jiàn)大量腫瘤細(xì)胞及散在壞死灶，癌旁組織內(nèi)可見(jiàn)排列較規(guī)則的腺體細(xì)胞及組織（圖1）。

圖1 HE 染色分析（×100） A-C：腫瘤組織；D-F：癌旁組織Figure 1 HE staining analysis (×100) A–C: Tumor tissue; D–F: Adjacent tissue

2.3 不同Nav 亞型在CRC 臨床標(biāo)本中表達(dá)分析

Nav1.1、Nav1.2、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.8、Nav1.9在CRC組織中均高表達(dá)（圖2A）。特別是Nav1.1、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.8的表達(dá)量相對(duì)于自身的癌旁組織提高了近 8倍（圖2A）。并且對(duì)Nav高表達(dá)的患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，Nav1.4、Nav1.6、Nav1.8高表達(dá)患者占患者總數(shù)的30%以上（圖2B）。

圖2 Nav 各亞型mRNA 表達(dá) A：Nav 各亞型mRNA 在癌組織中的相對(duì)于癌旁組織的表達(dá)量；B：Nav 各亞型高表達(dá)患者占比Figure 2 The mRNA expressions of Nav subtypes A: The expression level of each Nav subtype in tumor tissue relative to that in adjacent tissue; B: Proportion of patients with high expression of each Nav subtype

2.4 Nav 表達(dá)與CRC 的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其他侵襲性的關(guān)系

分析淋巴結(jié)陽(yáng)性與陰性組中Nav的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)陽(yáng)性組的CRC組織中Nav1.1、Nav1.6表達(dá)高于淋巴結(jié)陰性組（均P＜0.05），而其他的亞型表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（表3）。脈管侵潤(rùn)和神經(jīng)累犯與CRC的侵襲性相關(guān)，故分析了CRC標(biāo)本中脈管侵潤(rùn)與各Nav亞型表達(dá)之間的關(guān)系，統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示，脈管累犯患者的腫瘤組織中Nav1.6高表達(dá)（P=0.001），而Nav1.1與其他的亞型表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（表4）。

表3 淋巴結(jié)陽(yáng)性與陰性患者的腫瘤組織中各Nav 的表達(dá)（±s）Table 3 Expressions of Nav subtypes in tumors tissues of patients with positive and negative lymph nodes (±s)

表3 淋巴結(jié)陽(yáng)性與陰性患者的腫瘤組織中各Nav 的表達(dá)（±s）Table 3 Expressions of Nav subtypes in tumors tissues of patients with positive and negative lymph nodes (±s)

Nav 亞型 淋巴結(jié)陽(yáng)性 淋巴結(jié)陰性 t P Nav1.1 2.79±2.69 1.71±1.61 2.517 0.013 Nav1.2 2.03±2.35 1.9±1.93 0.148 0.883 Nav1.3 0.33±0.45 0.41±0.51 -0.754 0.453 Nav1.4 3.00±2.90 2.16±2.21 1.629 0.107 Nav1.5 1.62±1.33 1.17±1.17 1.790 0.077 Nav1.6 3.54±3.21 2.09±1.95 2.491 0.006 Nav1.7 1.77±1.75 2.12±2.45 -0.758 0.450 Nav1.8 3.03±2.73 2.57±1.93 0.100 8 0.331 Nav1.9 1.63±1.47 1.87±1.68 -0.736 0.464

表4 脈管侵潤(rùn)與無(wú)侵潤(rùn)患者的腫瘤組織中各Nav 的表達(dá)（±s）Table 4 Expressions of Nav subtypes in tumors tissues of patients with and without vascular infiltration (±s)

表4 脈管侵潤(rùn)與無(wú)侵潤(rùn)患者的腫瘤組織中各Nav 的表達(dá)（±s）Table 4 Expressions of Nav subtypes in tumors tissues of patients with and without vascular infiltration (±s)

Nav 亞型 脈管侵潤(rùn) 無(wú)脈管Nav1.1 2.70±2.90 2.31±1 Nav1.2 1.58±1.38 2.32±2 Nav1.3 0.40±0.51 0.37±0 Nav1.4 2.79±2.84 2.36±2 Nav1.5 1.41±1.38 1.30±1 Nav1.6 3.83±3.15 1.86±1侵潤(rùn) t P.98 0.791 0.431.48 -1.874 0.064.49 0.232 0.817.25 0.831 0.408.18 0.399 0.691.68 3.639 0.001 Nav1.7 2.60±2.58 1.57±1.85 2.287 0.024 Nav1.8 3.15±2.68 2.50±1.88 1.405 0.163 Nav1.9 1.41±1.30 2.06±1.78 -1.959 0.053

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果提示，Nav1.1、Nav1.6 的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈明顯正相關(guān)（r=0.272，P=0.006；r=0.234，P=0.019）；Nav 1.6 的表達(dá)與脈管累犯相關(guān)（r=0.341，P=0.001），而Nav1.1的表達(dá)與神經(jīng)累犯呈正相關(guān)（r=0.330，P=0.001）（表5）。

利用免疫組化分別檢測(cè)了來(lái)自5 例患者的陽(yáng)性淋巴結(jié)和陰性淋巴結(jié)中Nav1.1及Nav1.6的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在陽(yáng)性淋巴結(jié)中Nav1.6的表達(dá)高于陰性淋巴結(jié)（圖3A-B），而Nav1.1的表達(dá)則變化不明顯（圖3C-D）。通過(guò)統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性淋巴結(jié)中Nav1.1和Nav1.6陽(yáng)性著色區(qū)域（棕黃色區(qū)域）的平均光密度發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性淋巴結(jié)中Nav1.6的表達(dá)明顯高于Nav1.1（P＜0.05）（圖3E）。

表5 腫瘤組織中Nav1.1 及Nav1.6 的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵襲性的相關(guān)性Table 5 Correlations of Nav1.1 and Nav1.6 in tumor tissue with lymph node metastasis and invasiveness

圖3 免疫組化分析Nav1.1 及Nav1.6 在淋巴結(jié)中的表達(dá)（×400） A：Nav1.6 在陰性淋巴結(jié)中低表達(dá)；B：Nav1.6 在陽(yáng)性淋巴結(jié)中高表達(dá)；C-D：Nav1.1 在陽(yáng)性淋巴結(jié)和陰性淋巴結(jié)中均低表達(dá)；E：陽(yáng)性淋巴結(jié)中Nav1.1 和Nav1.6 陽(yáng)性著色區(qū)域（棕黃色區(qū)域）的平均光密度比較統(tǒng)計(jì)（n=5）Figure 3 Immunohistochemical staining for Nav1.1 and Nav1.6 expressions in the lymph nodes A: Low Nav1.6 expression in negative lymph node; B: High Nav1.6 expression in positive lymph node; C–D: Low Nav1.1 expressions in both positive and negative lymph nodes; E:Comparison of the average optical densities of positive staining regions (brown-staining areas) of Nav1.1 and Nav1.6 in the positive lymph nodes (n=5)

3 討 論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是CRC發(fā)生最早也是最常見(jiàn)的侵襲方式，是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素。臨床統(tǒng)計(jì)研究發(fā)現(xiàn)無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（同時(shí)無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）的患者，術(shù)后5年生存率可以達(dá)到80%以上；而伴發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（同時(shí)無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）術(shù)后5年生存率下降到55%左右[14-15]。目前針對(duì)CRC的VEGFR血管生成抑制劑、抗EGFR受體靶向藥已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，而腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未明確，更加沒(méi)有對(duì)應(yīng)的藥物。現(xiàn)有的淋巴細(xì)胞標(biāo)記物如VEGFR3是在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)比較特異的受體，但是在內(nèi)分泌器官中的有孔毛細(xì)血管以及單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞上均有表達(dá)，其作為腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移標(biāo)記物的特異性不足[16]。尋找更高特異性的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物將是闡明CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制的關(guān)鍵目標(biāo)。

惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程包含了復(fù)雜的分子機(jī)制，隨著腫瘤組織在原發(fā)灶的惡性增生，部分具有高侵襲力的腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶脫離，進(jìn)入周?chē)|(zhì)中，進(jìn)一步穿過(guò)淋巴管壁進(jìn)入淋巴系統(tǒng)，進(jìn)入?yún)^(qū)域淋巴結(jié)的邊緣竇，形成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶[3-4]。多種蛋白溶酶、細(xì)胞因子、離子通道及膜受體蛋白參與了這個(gè)進(jìn)程。電壓門(mén)控鈉通道由一個(gè)形成孔道的α亞基與一個(gè)或多個(gè)相關(guān)聯(lián)較小的β亞基組成。前期研究表明，多種Nav α亞基的異常表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但Nav過(guò)表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系仍不清楚[17]。本研究發(fā)現(xiàn)Nav1.1、Nav1.2、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.8、Nav1.9在CRC組織中均高表達(dá)，并且先前有報(bào)道[10]Nav1.5 α亞基是控制CRC細(xì)胞侵襲的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。盡管如此，Nav1.5主要表達(dá)于心肌細(xì)胞，是多個(gè)心臟疾病的潛在靶標(biāo)[18]，作為CRC進(jìn)展的標(biāo)記物進(jìn)行深入研究和開(kāi)發(fā)將有諸多掣肘。

研究[19]表明Nav1.6 在中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)中廣泛表達(dá)，也見(jiàn)于表皮游離神經(jīng)末端和腸道黏膜。Nav 1.6 的突變與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，如癲癇、神經(jīng)病理性疼痛等[19]。近年的研究[17,20]發(fā)現(xiàn)Nav1.6在乳腺癌、宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種實(shí)體瘤中均有表達(dá)。Nav1.6的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌的轉(zhuǎn)移和侵襲，采用Nav1.6抑制劑特異性阻斷宮頸癌細(xì)胞中Nav1.6電流后可降低其細(xì)胞侵襲性[21]。這些結(jié)果表明，Nav1.6的表達(dá)和功能異常能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)分析高表達(dá)的Nav與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，僅有Nav1.1，Nav1.6的高表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示了這兩者可能參與了CRC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

脈管累犯是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的第一步，預(yù)示著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加。本結(jié)果提示，Nav1.6在CRC組織中的高表達(dá)與腫瘤的脈管累犯呈現(xiàn)正相關(guān)。而Nav1.1則只和神經(jīng)累犯呈現(xiàn)正相關(guān)。Nav1.1主要表達(dá)于神經(jīng)組織，然而近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)Nav1.1也表達(dá)于外周感覺(jué)神經(jīng)[22]。這個(gè)結(jié)果提示Nav1.1可能參與CRC的神經(jīng)累犯，其具體機(jī)制尚需深入研究。免疫組化結(jié)果顯示，在陽(yáng)性淋巴結(jié)中Nav1.6呈現(xiàn)高表達(dá)。這個(gè)結(jié)果提示進(jìn)入淋巴結(jié)的腫瘤細(xì)胞可能主要是Nav1.6陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，Nav1.6陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移性。這些結(jié)果提示，Nav1.6可能參與了CRC細(xì)胞由病灶向周?chē)|(zhì)侵犯，并通過(guò)脈管向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過(guò)程。但是其關(guān)鍵分子機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步研究。

總而言之，本研究考察了不同Nav亞型在CRC中的表達(dá)情況，分析了各Nav亞型的表達(dá)與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，并發(fā)現(xiàn)了Nav 1.1 及Nav1.6的過(guò)表達(dá)與CRC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，期以為探討以電壓門(mén)控鈉通道作為新CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷分子標(biāo)記物提供理論借鑒。