季春宜，尹強(qiáng)，袁妙賢，陳立健，謝惟心

（湖南省兒童醫(yī)院 普外一科，湖南 長沙 410007）

先天性巨結(jié)腸（hirschsprung disease，HD）是一種以腸道神經(jīng)系統(tǒng)先天性缺陷為主要病理特征的復(fù)雜遺傳性消化道異常病變，其病變機(jī)制與多種易感基因的異常表達(dá)密切相關(guān)，進(jìn)而介導(dǎo)結(jié)腸神經(jīng)異常發(fā)育，腸管失去正常蠕動發(fā)生痙攣、便秘和腹脹等多種臨床癥狀[1-3]。臨床上手術(shù)切除術(shù)仍是針對HD患者的有效治療手段，而關(guān)于HD患者腸管動力障礙的病理生理機(jī)制尚不明確。近年來，有關(guān)HD 患者的結(jié)腸動力障礙機(jī)制的研究主要以結(jié)腸炎性病變?yōu)榻裹c(diǎn)[4-5]。研究[6-8]報道，信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）蛋白家族在多種遺傳性疾病中異常表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體、Toll樣受體、IL-6受體等信號通路被激活，持續(xù)性的STAT3活化導(dǎo)致下游信號基因及信號通路的轉(zhuǎn)錄失調(diào)和異常表達(dá)，從而促進(jìn)多種疾病的發(fā)生發(fā)展。此外，研究[9]表明STAT3作為特異性炎癥調(diào)控因子，既能維持疾病進(jìn)展所需炎性環(huán)境，同時發(fā)揮較強(qiáng)的機(jī)體抗炎免疫應(yīng)答。然而，STAT3在HD進(jìn)程中的表達(dá)及意義尚未見報道。因此，本文探討HD患者結(jié)腸病變組織中STAT3及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt信號通路中主要蛋白表達(dá)的變化，以期為揭示臨床HD患者結(jié)腸動力障礙作用機(jī)制提供新視角和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

先天性巨結(jié)腸患兒病變及正常結(jié)腸組織源自湖南省兒童醫(yī)院；S-P免疫組化檢測試劑盒購自美國Zymed生物公司；PCR引物由上海吉瑪生物公司合成；實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑購自日本Takara生物公司；STAT3、KLF4、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt和GAPDH一抗分別購自英國Abcam和美國Cell Signaling Technology生物公司；辣根過氧化物酶（HPR）標(biāo)記的二抗購自武漢博士德生物科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 S-P 免疫組化染色檢測STAT3 組織陽性表達(dá)及定位將上述HD 患者的結(jié)腸病變和正常組織經(jīng)石蠟切片為4～5 μm 組織薄片后脫蠟，滴加3%甲醇雙氧水室溫靜止10 min 以封閉內(nèi)源性過氧化物酶；采用0.01 mol/L（pH7.2）的PBS 緩沖液室溫清洗3 次，5 min/次。隨后滴加0.01 mol/L（pH6.0）的檸檬酸緩沖液于微波爐中煮沸2 次以進(jìn)行組織抗原修復(fù)。取出薄片待自然冷卻后采用PBS 清洗后加入二抗同源動物非免疫血清室溫封閉10 min，隨后滴加適度比例稀釋的STAT3 一抗4 ℃過夜；次日，取出薄片采用PBS 室溫清洗3 次，5 min/ 次，滴加生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育10 min，PBS 洗PBS 室溫清洗3 次，5 min/ 次；滴加鏈親和素- 過氧化物酶室溫靜置10 min，PBS 洗PBS 室溫清洗 3 次，5 min/ 次。最后采用新鮮配制的DAB 溶液室溫顯色并密切觀察組織染色情況，自來水洗后，采用蘇木素淺染細(xì)胞核，分化；最后用自來水沖洗、梯度酒精脫水、二甲苯透明后用中性樹膠封片，顯微觀察上述分子的組織表達(dá)及分布情況并統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)和拍照記錄。染色結(jié)果根據(jù)細(xì)胞著色程度差異分級表示，（-）表示陰性細(xì)胞，（+）表示淡棕黃色細(xì)胞，（++）表示處于淡棕黃色和深棕黃色之間的細(xì)胞，（+++）表示深棕黃色[10]。

1.2.2 qRT-PCR 檢測RNA 表達(dá)采用TRIzol 裂解液提取上述收集HD 患者結(jié)腸病變組織和正常組織總RNA，采用Takara 公司5×PrimeScript RT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，qRT-PCR嚴(yán)格按照Takara 公司2×SYBR Premix Ex Taq II說明書進(jìn)行。采用儀器自帶軟件進(jìn)行分析，基因相對表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCT法進(jìn)行計算，以GAPDH 作為內(nèi)參基因，檢測組織樣本中STAT3、miR-92a、KLF4、PI3K 和Akt 的RNA 表達(dá)水平，qRT-PCR引物序列如表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.2.3 Western blot 檢測蛋白表達(dá)采用適量PIPA+PMSF 組織裂解液裂解上述收集HD 患者結(jié)腸病變組織和正常組織總蛋白，室溫靜置5 min，4 ℃離心機(jī)12 000r/min 離心15 min，取上清置于新的1.5 mL 的EP 管中，記錄蛋白總體積。采用BCA 法檢測蛋白初始濃度并計算30 μg 蛋白上樣體積，采用SDS-PAGE 蛋白凝膠進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂牛奶封閉后，采用適當(dāng)比例稀釋的STAT3、KLF4、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 和GAPDH 一抗稀釋液4 ℃過夜孵育；次日，棄一抗，采用TBST 室溫清洗后與1:3 000 比例稀釋的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，采用TBST 室溫清洗后，采用ECL 發(fā)光儀和Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)檢測并記錄蛋白表達(dá)量并進(jìn)行灰度掃描分析，每組樣品重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0和GraphPad Prism 7軟件。組間計量資料比較采用t檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；采用Spearman進(jìn)行相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 S-P 免疫組化檢測STAT3 的組織陽性表達(dá)及定位情況

S-P 免疫組化檢測H D 患者結(jié)腸病變組織中STAT3的陽性表達(dá)及定位結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，HD患者病變結(jié)腸組織中STAT3的陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于正常結(jié)腸組織[（28.35±2.45）個vs.（14.24±3.67）個，P＜0.05]。

2.2 qRT-PCR 檢測STAT3 及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt 信號軸分子RNA 表達(dá)

qRT-PCR檢測HD患者結(jié)腸病變組織中STAT3及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt信號軸分子RNA表達(dá)，結(jié)果表明，H D 患者病變結(jié)腸組織中STAT3、miR-92a和KLF4/PI3K/Akt信號通路標(biāo)志分子RNA表達(dá)較正常組織均明顯上調(diào)（均P＜0.05）（圖2）。

圖1 S-P 免疫組化檢測HD 患者結(jié)腸組織中STAT3 的表達(dá)與分布情況（×40）

圖2 qRT-PCR 檢測STAT3 及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt 信號軸分子RNA 表達(dá)

2.3 Western blot 檢測檢測STAT3及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt 信號軸分子蛋白表達(dá)

Westernblot檢測HD患者結(jié)腸病變組織中STAT3及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt信號軸分子蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，HD患者病變結(jié)腸組織中STAT3、KLF4、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)較正常組織均明顯上調(diào)（均P＜0.05），而PI3K和Akt表達(dá)量兩者之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）（圖3）。

2.4 HD 患者結(jié)腸病變組織中STAT3 和miR-92a的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果表明，HD患者病變結(jié)腸組織中STAT3 和miR-92a的表達(dá)呈明顯正相關(guān)（r=0.992，P=0.003）。

圖3 Western blot 檢測STAT3 及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt 信號軸分子蛋白表達(dá)

3 討 論

HD是臨床小兒高發(fā)的腸道疾病，其誘因和發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明明確。研究發(fā)現(xiàn)多種因素包括機(jī)體近端腸管機(jī)械性擴(kuò)張、腸道感染、腸黏膜機(jī)械障礙、黏膜神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞減少以及基因表達(dá)異常均與HD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，上述因素均可導(dǎo)致患者腸管擴(kuò)張產(chǎn)生腹脹、爆發(fā)行水樣瀉、發(fā)熱等非典型癥狀。嚴(yán)重者腸神經(jīng)元的缺失導(dǎo)致病變節(jié)段的緊張性收縮，導(dǎo)致功能性胃腸道梗阻[11-12]。臨床上針對HD的治療方法是手術(shù)切除術(shù)腸管并進(jìn)行結(jié)腸肛管吻合術(shù)[13]。然而，結(jié)腸受累程度不僅影響患者臨床表現(xiàn)，而且影響預(yù)后和可用的治療方案。盡管手術(shù)治療對患者具有一定臨床效果，但全結(jié)腸和小腸/廣泛的梗阻患者較高的病死率以及患者術(shù)后較高的大小便失禁和便秘發(fā)生率大大降低臨床療效與滿意度[14]。因此，尋找有效的治療手段或治療靶點(diǎn)成為臨床HD患者治療的重要難題。

目前關(guān)于HD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究表明可能與基因多態(tài)性、腸黏膜屏障受損、慢性持續(xù)性炎癥等因素有關(guān)[15]。炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子STAT3及家族成員在多種炎性病變組織內(nèi)呈異常過表達(dá)，且與患者的病變程度密切相關(guān)。STAT3作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控下游多種細(xì)胞因子的表達(dá)和信號通路活性，參與機(jī)體多種生理病理進(jìn)程[16]。近年來大量研究證實(shí)STAT3炎性信號通路在多種惡性腫瘤中異?；罨⒛軌虼龠M(jìn)惡性腫瘤的炎-癌轉(zhuǎn)化，靶向STAT3信號有望為臨床抗腫瘤治療提供新靶點(diǎn)[17-18]。STAT3是最常見的炎癥標(biāo)志物，可能參與HD的發(fā)病過程。本研究采用免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HD患者病變結(jié)腸組織中STAT3的陽性表達(dá)較正常結(jié)腸組織顯著升高，提示STAT3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在誘發(fā)HD進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

miR-92a是一種細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的較小的非編碼RNA，能夠參與體內(nèi)基因表達(dá)的調(diào)控繼而參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種生物學(xué)信號通路[19]。最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a的突變或異常表達(dá)與多種人類炎性反應(yīng)以及惡性腫瘤進(jìn)程密切相關(guān)[20]。研究表明多種機(jī)體炎性疾病中miR-92a表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而抑制機(jī)體抗炎能力，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的持續(xù)以及腫瘤的炎-癌轉(zhuǎn)化進(jìn)程，在臨床慢性致炎疾病的診療中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究報道致炎因子STAT3的異常表達(dá)能夠上調(diào)miR-92a的表達(dá)，繼而參與調(diào)控炎癥進(jìn)展，然而HD患者病理進(jìn)程中兩者之間的相互作用及對對疾病影響尚無明確報道[21-22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HD患者病變組織中STAT過表達(dá)能夠顯著上調(diào)miR-92a的轉(zhuǎn)錄水平，提示STAT3和miR-92a的相互作用在促進(jìn)HD患者病變進(jìn)程中發(fā)揮協(xié)同作用。

KLF4/PI3K/Akt信號通路是哺乳動物體內(nèi)廣泛存在的經(jīng)典信號通路，在介導(dǎo)細(xì)胞分化、增殖、自噬、凋亡等多種進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[23-24]。研究[25]顯示，KLF4/PI3K/Akt信號通路異?；罨軌蛘T導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生和進(jìn)展。另外，在持續(xù)炎癥環(huán)境下，活化的Akt還可以激活NF-κB，提高病變組織內(nèi)TNF-α、IL-6等促炎性因子的轉(zhuǎn)錄水平，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，加重組織損傷[26]。本研究通過對比HD患者結(jié)腸病變及正常組織中KLF4/PI3K/Akt信號通路標(biāo)志分子活性，結(jié)果顯示HD患者病變結(jié)腸組織中KLF4/PI3K/Akt信號通路標(biāo)志分子的總RNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常結(jié)腸組織。此外，相關(guān)性分析結(jié)果表明HD患者病變結(jié)腸組織中STAT3和miR-92a的表達(dá)呈明顯正相關(guān)（r=0.992，P=0.003）。綜上所述，致炎信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子STAT3通過上調(diào)miR-92a的轉(zhuǎn)錄水平，介導(dǎo)KLF4/PI3K/Akt信號通路活化，誘導(dǎo)先天性巨結(jié)腸的發(fā)生發(fā)展，靶向STAT3及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt信號軸，有望為臨床先天性巨結(jié)腸的預(yù)防及診療提供新治療靶點(diǎn)和理論依據(jù)。