陳佩 馬彧博

(國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作天津中心，天津 300304)

百合是百合科百合屬多年生草本球根植物，百合花姿優(yōu)雅，是世界著名的觀賞花卉之一，全球已發(fā)現(xiàn)110多個(gè)品種，其中55種產(chǎn)于中國。百合除具有觀賞價(jià)值外，其干燥的肉質(zhì)鱗葉還可食用、藥用，具有養(yǎng)陰潤肺，清心安神之功效。傳統(tǒng)的百合繁殖方法主要采用分球、分珠芽、鱗片扦插等。但是上述繁殖方法繁殖系數(shù)低且容易造成品種退化以及病毒的積累[1]，組織培養(yǎng)不受時(shí)間的限制，可以采用多種器官或者組織建立百合的再生體系，從而達(dá)到快速繁殖百合植株的目的。目前主要通過4種途徑建立百合的再生體系，通過脫分化形成愈傷組織、再分化形成芽、增殖和生根培養(yǎng)得到再生植株；通過直接誘導(dǎo)不定芽，對(duì)不定芽進(jìn)行增殖和生根培養(yǎng)得到再生植株；誘導(dǎo)小鱗莖途徑，通過外植體誘導(dǎo)得到小鱗莖，對(duì)小鱗莖進(jìn)行生根培養(yǎng)；體細(xì)胞胚狀體途徑，通過愈傷組織誘導(dǎo)得到球形胚或者外植體直接形成胚狀體，進(jìn)行分化培養(yǎng)得到再生植株[2]。另外，利用組織培養(yǎng)結(jié)合莖尖培養(yǎng)可以得到脫毒百合，將組織培養(yǎng)與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化結(jié)合能得到產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)且抗逆性強(qiáng)的百合新品種；將組織培養(yǎng)與多倍體誘變結(jié)合能選育出更多的優(yōu)良品種。本文以百合組織培養(yǎng)技術(shù)為入口進(jìn)行專利檢索和分析，揭示百合組培再生相關(guān)專利脈絡(luò)，為企業(yè)或者研究院所提供信息。

1 百合組織培養(yǎng)技術(shù)中國發(fā)明專利申請(qǐng)情況

在國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局自主開發(fā)的專利檢索與服務(wù)系統(tǒng)(S系統(tǒng))和Incopat專利檢索平臺(tái)上以關(guān)鍵詞結(jié)合分類號(hào)檢索獲取專利信息，共得到447篇專利文獻(xiàn)。由于專利法規(guī)定自申請(qǐng)日起滿18個(gè)月即行公布，也可以根據(jù)申請(qǐng)人的請(qǐng)求早日公布，即專利公布時(shí)間相對(duì)滯后，因此2019年及以后的數(shù)據(jù)僅作參考。

1.1 申請(qǐng)趨勢(shì)分析

百合組培技術(shù)專利在中國的申請(qǐng)量分布見圖1。

圖1 百合種質(zhì)技術(shù)專利在中國的申請(qǐng)分布

由圖1可知，2002—2009年間，百合組培技術(shù)專利申請(qǐng)量較低；2011—2014年申請(qǐng)量處于增長階段。尤其在2014年達(dá)到申請(qǐng)量的最高峰，可能與國家扶持農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展以及支持農(nóng)業(yè)特色農(nóng)產(chǎn)品發(fā)展的政策相關(guān)。如，國務(wù)院以國發(fā)〔2012〕10號(hào)印發(fā)《關(guān)于支持農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化龍頭企業(yè)發(fā)展的意見》。另外，百合還可作為中藥，國家也將中藥材的發(fā)展作為經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要舉措，如，國家2015年出臺(tái)的《中藥材保護(hù)和發(fā)展規(guī)劃(2015—2020年)》、2016年印發(fā)的《中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃綱要(2016—2030年)》[3]。隨著國家鄉(xiāng)村振興的實(shí)施，百合的組織培養(yǎng)技術(shù)也會(huì)不斷增長。

1.2 百合組織培養(yǎng)專利中國申請(qǐng)主要申請(qǐng)人分析

由圖2可以看出，百合組培專利相關(guān)的申請(qǐng)人主要是國內(nèi)的高校和研究所，其中昆明理工大學(xué)和云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所申請(qǐng)量較多，主要是因?yàn)樵颇侠ッ鞫纺蠂H花卉市場(chǎng)是亞洲第1花卉批發(fā)市場(chǎng)，百合花作為市場(chǎng)需求量廣泛的花卉之一，在云南種植廣泛。另外，北京林業(yè)大學(xué)、浙江大學(xué)以及長江師范學(xué)院申請(qǐng)量相當(dāng)?？梢?，無論是北方、南方還是中部地區(qū)對(duì)百合組培研究都比較多。

圖2 百合組培技術(shù)專利主要申請(qǐng)人及申請(qǐng)量

1.3 技術(shù)領(lǐng)域分布

通過統(tǒng)計(jì)專利設(shè)計(jì)的國際專利分類號(hào)(IPC)，對(duì)百合組培技術(shù)領(lǐng)域進(jìn)行分析，如表1所示。百合主要的分類號(hào)是A01H，新植物或獲得新植物的方法，通過組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生；C12N，微生物或酶，其組合物，繁殖、保藏或維持微生物，變異或遺傳工程，培養(yǎng)基；C12Q包含酶、核酸或微生物的測(cè)定或檢驗(yàn)方法。也有一定數(shù)量關(guān)于A01G園藝；蔬菜、花卉、稻、果樹、葡萄、啤酒花或海菜的栽培。上述4個(gè)領(lǐng)域涵蓋了組織培養(yǎng)再生，百合的遺傳轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)基、百合育種中的檢測(cè)以及百合的種植方向。

圖3 技術(shù)領(lǐng)域分布

2 專利技術(shù)研究路線分析

2.1 外植體的選擇

百合組培再生中鱗片是普遍采用的外植體，但鱗莖在土壤中帶病毒較多，病毒在植株體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制繁殖，在組織培養(yǎng)中容易出現(xiàn)真菌污染，同時(shí)繼代培養(yǎng)的過程中也較容易出現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌的再次污染，因此莖段、種胚/種子、花藥、花絲也是常見的外植體類型。如，CN110810240A公開了以健康母株的莖段作為外植體，誘導(dǎo)不定芽和對(duì)不定芽增殖培養(yǎng)得到無菌苗的方法；CN110771501A公開了以百合種子進(jìn)行萌發(fā)、分化得到無菌幼苗，并對(duì)幼苗進(jìn)行增殖、鱗莖誘導(dǎo)和生根、煉苗移栽的方法；CN108633743A公開了以百合花藥為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)再生的方法；CN103798142A公開了以百合花絲為外植體，誘導(dǎo)胚性愈傷組織得到污染率低、誘導(dǎo)率高、再生能力強(qiáng)、增殖率高的再生方法。

2.2 再生途徑

在適宜的條件下培養(yǎng)莖段、莖尖、芽等器官，利用外植體已經(jīng)存在的芽器官，通過以芽繁芽的再生方法得到完整植株是百合常見的器官型再生方式，在理論上該途徑再生得到的后代基因型與母體基本一致，可較好地保持母本特性。如，CN108834895A公開了以百合莖尖為外植體，在MS加6-BA加NAA培養(yǎng)基中進(jìn)行芽誘導(dǎo)和伸長培養(yǎng)得到再生植株的方法，該方法再生率高；CN106718873A公開了以百合的莖尖或腋芽為外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)、不定芽增殖，繁殖系數(shù)可達(dá)4～5倍。

利用各分生組織或器官在添加植物激素的培養(yǎng)基中進(jìn)行脫分化、再分化的愈傷途徑也是百合常見的器官發(fā)生型再生途徑。如，CN108633743A公開了以百合花藥為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到35%以上；CN108450333A公開了以百合鱗片或珠芽接種在MS加6-BA加NAA加KT加2,4-D進(jìn)行愈傷的誘導(dǎo)和不定芽的分化，20d就能得到愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)71%；CN107173236A公開了以百合種子為外植體，接種在1/2MS加2,4-D加NAA加6-BA加殺菌中草藥中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)的方法，該方法提高了百合愈傷組織的抗感染能力。

百合是常見的球根花卉，利用外植體在合適的條件下直接誘導(dǎo)形成帶根的小鱗莖是百合再生中特殊的小鱗莖途徑。CN107396835A公開了以百合中部或者基部鱗片為外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)、鱗莖增殖的再生方法；CN107736251A公開了以鱗莖為外植體，在MS加IBA加細(xì)胞分裂素加油菜素內(nèi)酯加茉莉酸甲酯誘導(dǎo)小鱗莖，并對(duì)鱗莖進(jìn)行膨大、生根、催芽的再生方法，該方法提高了繁殖系數(shù)、縮短了繁殖周期；CN10754907A公開了對(duì)百合莖桿葉腋葉面噴施吲哚乙酸和表油菜素內(nèi)酯的混合物進(jìn)行莖生小鱗莖誘導(dǎo)、小鱗莖催芽生長的方法，每株可誘導(dǎo)6～10個(gè)小鱗莖，繁殖系數(shù)高。

在離體條件下，外植體產(chǎn)生類似胚胎的發(fā)生和發(fā)育的過程是百合再生中的體胚誘導(dǎo)途徑，體細(xì)胞胚減少了植株的變異性。如，CN110972955A公開了以葉為外植體在MS加NAA加2,4-D/6-BA/PIC進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)，將胚性愈傷組織在MS加6-BA加NAA進(jìn)行增殖培養(yǎng)得到體細(xì)胞胚的再生方式；CN108464242A公開了以百合無菌苗的外層鱗片接種于MS加PIC加ABA的培養(yǎng)基中進(jìn)行原胚誘導(dǎo)，在MS加PIC加NAA進(jìn)行體胚增殖培養(yǎng)，并對(duì)體胚進(jìn)行萌發(fā)和成苗培養(yǎng)的方法，該方法體胚誘導(dǎo)時(shí)間短、體胚質(zhì)量佳。

2.3 組織培養(yǎng)在種質(zhì)資源和育種中的應(yīng)用

2.3.1 組織培養(yǎng)與脫毒

百合作為球根花卉，常采用鱗莖、鱗片等進(jìn)行繁殖，容易發(fā)生病毒感染，病毒病嚴(yán)重影響了百合的生產(chǎn)，常見的病毒病有黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒。通過組織培養(yǎng)可得到脫毒植株，將組織培養(yǎng)與莖尖培養(yǎng)、熱處理以及化學(xué)試劑結(jié)合進(jìn)行脫毒。如，CN11280059A公開了以中內(nèi)層健康的鱗片為外植體培養(yǎng)得到無菌苗，切取無菌苗小鱗片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，隨后分化誘導(dǎo)得到無毒的成苗，該方法能快速高效得到脫毒苗；CN110268980A公開了以健康鱗莖為外植體得到無菌苗，再將無菌苗進(jìn)行熱處理，以熱處理的莖尖為外植體進(jìn)行脫毒培養(yǎng)得到脫毒苗。

2.3.2 組織培養(yǎng)與離體保存

離體培養(yǎng)的植株、器官或細(xì)胞通過限制、延緩或停止其生長的方法保存，占據(jù)空間小，便于交流利用，避免種質(zhì)丟失。高滲透壓保存是百合種質(zhì)資源保存中常見的1種方式。如，CN101796925A公開了將誘導(dǎo)再生的鱗莖芽切去芽頂部和部分基部組織后，接種在1/2MS加NAA加PP333加甘露醇加AC的離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)基中，使得離體保存的效率提高50%～60%。通過降低溫度減弱培養(yǎng)物的生命活動(dòng)從而達(dá)到抑制生長、保存種質(zhì)的目的也是百合種質(zhì)保存中常見的方式。如，CN110367125A公開了在百合鱗莖培養(yǎng)期間進(jìn)行間隔性的低溫刺激，隨后恢復(fù)常溫培養(yǎng)小鱗莖，再將百合鱗莖在常溫、低溫、超低溫條件下保存，通過對(duì)百合鱗莖提前進(jìn)行馴化，避免其在超低溫條件保存時(shí)出現(xiàn)凍傷，導(dǎo)致活性喪失；CN104255711A公開了采用玻璃化超低溫保存方法對(duì)百合胚性愈傷組織進(jìn)行保存，通過向冷凍保護(hù)劑中添加納米材料有效提高保護(hù)劑的粘度和熱導(dǎo)率，使得保存后的恢復(fù)生長率顯著提高。

2.3.3 組織培養(yǎng)與多倍體誘變

遠(yuǎn)緣雜交是百合育種的重要手段，然而遠(yuǎn)緣雜種間由于染色體不能正常分離表現(xiàn)出不育，限制了遠(yuǎn)緣雜交在百合育種中的應(yīng)用，通過秋水仙素、氟樂靈對(duì)花藥培養(yǎng)得到的單倍體加倍或者體細(xì)胞染色體加倍可有效解決這一問題。如，CN106106152A公開了在誘導(dǎo)前采用秋水仙素對(duì)材料進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，繼而對(duì)不定芽進(jìn)行繼代培養(yǎng)分離嵌合體，之后進(jìn)行叢生芽生長和生根培養(yǎng)得到純合四倍體材料，該方法誘導(dǎo)率高，四倍體植株生長正常、倍性穩(wěn)定，可作為新品種培育的重要種質(zhì)材料。另外，百合三倍體具有特異的品種和營養(yǎng)生長優(yōu)勢(shì)，常規(guī)的方法是將四倍體和二倍體雜交，但是該方法周期短，采用組織培養(yǎng)結(jié)合誘變能快速得到三倍體百合。如，CN1579144A公開了采用秋水仙素點(diǎn)滴法處理花芽，按照常規(guī)栽培技術(shù)繼續(xù)培養(yǎng)上述植株，將三倍體胚接種在MS加6-BA加GA3培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)、染色體鑒定，將最終確定的三倍體植株的鱗片接種在MS加6-BA加NAA繼代培養(yǎng)，選育出三倍體百合新類型。

2.3.4 組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化

百合同時(shí)具有觀賞、食用、藥用價(jià)值，其種質(zhì)資源遺傳變異豐富，培育花型優(yōu)美、花色豐富，抗鹽、堿、旱、病蟲害等抗逆性強(qiáng)的百合品種是當(dāng)前市場(chǎng)的需求，然而傳統(tǒng)的雜交育種存在周期長的問題。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是改良植物的有效手段。如，CN1561697A公開了1種百合遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的方法，其以百合鱗莖或花絲為外植體建立高頻的再生系統(tǒng)，通過抗生素敏感試驗(yàn)確定了篩選濃度，建立了高效的轉(zhuǎn)化體系；CN101302519A公開了以麝香百合的鱗莖為外植體得到無菌苗，從半夏中克隆pta基因構(gòu)建載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pta基因轉(zhuǎn)化百合葉片得到抗性再生植株，最終獲得抗蚜蟲型提高的轉(zhuǎn)基因百合；CN101302518A公開了從百合中克隆Liaco基因的反義片段，構(gòu)建表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將antiLlaco轉(zhuǎn)入百合得到轉(zhuǎn)基因植株，通過衰老試驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)化植株的耐衰老性，得到壽命延長的轉(zhuǎn)基因百合植株。

3 結(jié)語

百合具有較高的商品價(jià)值，通過組織培養(yǎng)可快速得到再生百合幼苗，目前對(duì)百合高效再生體系的研究較多，如何進(jìn)一步優(yōu)化再生方法得到繁殖系數(shù)高、周期短、成本低的再生體系，以及進(jìn)一步將組織培養(yǎng)與雜交育種、誘變育種、種質(zhì)資源保存、脫毒、遺傳轉(zhuǎn)化相結(jié)合是百合組培工廠化生產(chǎn)中的研究方向。