李重 陳飛 王洪偉

結直腸癌是發(fā)病率和死亡率位于前列的消化系統(tǒng)惡性腫瘤［1］。化療是結直腸癌治療的重要手段，特別是對于晚期結直腸癌患者，化療能夠抑制腫瘤生長，縮小腫瘤體積和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。以氟尿嘧啶和卡培他濱為代表的細胞毒性藥物，能夠抑制胸苷合成酶的活性，從而抑制DNA復制［2］。奧沙利鉑是另外一種常用于治療結直腸癌的細胞毒性藥物。奧沙利鉑通過與DNA分子共價結合，形成DNA加合物，抑制腫瘤細胞增殖和誘導G2期阻滯［3］。在結直腸癌治療中，上述兩種藥物的聯(lián)合治療已經(jīng)廣泛應用。雖然多數(shù)患者初始對于奧沙利鉑和氟尿嘧啶的反應良好，但是仍然有部分患者最終出現(xiàn)復發(fā)。有研究顯示，復發(fā)的結直腸癌患者5年生存率不足10%［4］。所以，探索結直腸癌患者復發(fā)的分子標志物具有重要的臨床意義。

腫瘤的復發(fā)涉及腫瘤細胞與微環(huán)境之間復雜的相互作用。近些年來腸道微生物的研究逐步開展，發(fā)現(xiàn)了腸道菌群與結直腸癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關。腸道菌群可以通過影響腸道內(nèi)的炎癥水平和腫瘤細胞生長相關的信號通路，發(fā)揮促進腫瘤生長的功能［5-8］。一項利用小鼠模型的研究顯示，腸道菌群能夠影響腸道黏膜內(nèi)的免疫狀態(tài)，從而影響化療和免疫治療的效果［9-10］。人類消化道中的菌群也與炎性細胞因子的產(chǎn)生有關［11］。糞腸球菌是一種消化道常見的革蘭氏陽性球菌。目前，已經(jīng)有文獻報道，糞腸球菌豐度在結直腸癌中顯著高于結直腸息肉患者和健康人群［12］。糞腸球菌能夠促進結直腸腫瘤細胞系的增殖［13］，而且可以通過葡萄糖醛酸磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)加快結腸炎的發(fā)展［14］。糞腸球菌感染可能與慢性胰腺炎及腫瘤的發(fā)生有一定的關系［15］。由此可見，糞腸球菌在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。但是，目前糞腸球菌與腫瘤復發(fā)之間的關系尚未見報道。

在本研究中，我們通過選取哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院普外科結直腸癌復發(fā)患者與非復發(fā)患者的糞便樣本。通過16s測序技術，探索腸道菌群與結直腸腫瘤復發(fā)的關系。闡述糞腸球菌對結直腸癌復發(fā)的臨床意義。

材料與方法

一、臨床樣本的選擇

本研究所有的患者及樣本均來自于哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院普外科。自2015年1月至2016年12月，共103例患者經(jīng)病理診斷為結直腸癌，術前通過胸部及全腹CT排除遠處臟器轉(zhuǎn)移。同時收集患者的臨床信息及糞便樣本。所有患者均接受手術治療，外科手術后，患者接受標準的XELOX方案化療，根據(jù)RECIST標準診斷共有復發(fā)患者39例，非復發(fā)患者64例［18］。匹配年齡、性別及腫瘤分期等臨床指標后，選擇10對復發(fā)與非復發(fā)患者用于16sRNA測序，其余29例復發(fā)患者及54例非復發(fā)患者用于PCR驗證。本研究方案經(jīng)過哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院倫理委員會批準，手術前患者均簽署了知情同意書。使用胸部及全腹增強CT及腸鏡檢測患者術后復發(fā)情況，并進行電話隨訪，隨訪間隔為3個月，連續(xù)隨訪3年。

二、16s高通量測序

共收集103份糞便樣本，DNase酶處理后，經(jīng)過RNeasy Mini柱分離純化獲得高純度RNA。分離的RNA樣本使用安捷倫2 100 Bioanalyzer進行質(zhì)量控制。RNA樣本在Illumina Hiseq 3000平臺進行150 bp的雙端測序。RNA測序數(shù)據(jù)使用TopHat-HTSeq-DeSeq2軟件處理［16］。測序讀數(shù)數(shù)據(jù)使用TopHatv2.0.11軟件比對（humangenome，hg19）［17］。根據(jù)Ensembl_GRCh37數(shù)據(jù)庫默認值建立基因名稱索引。通過HTSeq包和GTF注釋文件，將測序數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)化為讀數(shù)文件。將每個樣本的讀數(shù)文件整理為表達矩陣，用于后續(xù)差異表達的篩選。使用DESeq2包篩選差異表達基因，其中讀數(shù)小于5的基因認為無表達，不予以分析。

三、糞腸球菌檢測

根據(jù)既往研究的報道，合成檢測糞腸球菌所需要的引物。新鮮糞便樣本中的基因組DNA通過QIAamp DNA Mini試劑盒提取。每個樣本的基因組DNA用于PCR檢測糞腸球菌表達量的檢測。反應體系配制如下：40 ng的gDNA，10 μL的1×Power SYBR Green PCR混合液，0.4 μM的正向與反向引物置于96孔板中。通過ABI公司7500 Real-Time PCR System擴增檢測糞腸球菌的表達。擴增條件如下：95℃10分鐘；95℃15秒鐘，反復40循環(huán)；60℃持續(xù)1分鐘。糞腸球菌的表達量用Ct值表示。

四、統(tǒng)計學分析方法

所有統(tǒng)計學分析使用R軟件完成（www.rproject.org）。所有實驗數(shù)據(jù)至少經(jīng)過三次獨立實驗驗證，并且以均數(shù)±標準差展示。使用單樣本的Kolmogorov-Smirnov檢驗數(shù)據(jù)是否滿足正態(tài)分布。如果數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，兩組數(shù)據(jù)之間的比較使用獨立樣本t檢驗，多組之間的比較使用單樣本方差分析。如果樣本不滿足正態(tài)分布，使用非參數(shù)檢驗，兩樣本之間的比較使用Mann-Whitney檢驗。生存數(shù)據(jù)使用Kaplan-Meier曲線分析。所有統(tǒng)計學分析均為雙尾檢驗，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、糞便糞腸球菌與結直腸腫瘤患者的復發(fā)相關

本研究對10對結直腸腫瘤復發(fā)患者和非復發(fā)患者糞便樣本進行16s測序分析。根據(jù)測序數(shù)據(jù)結果進行主成分分析（principle component analysis，PCA），發(fā)現(xiàn)16s數(shù)據(jù)可以對復發(fā)患者和非復發(fā)患者進行區(qū)分（圖1）。對16s測序數(shù)據(jù)，進行線性判別分析（linear discrimination analysis，LDA），同時篩選得到在復發(fā)患者中豐度增高的菌群，如糞腸球菌、具核梭桿菌、脆弱擬桿菌；也篩選得到了在復發(fā)患者中豐度降低的菌群，如韋榮氏球菌、窄食單胞菌等；本研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌在復發(fā)患者糞便中豐度最高，作為后續(xù)研究的潛在靶點（圖2）。根據(jù)我們收集的另外83例樣本進行PCR檢測，本研究發(fā)現(xiàn)在復發(fā)的患者糞便中，糞腸球菌的豐度更高（圖3）。

圖1 10對復發(fā)與非復發(fā)患者糞便樣本PCA分析

圖2 16s測序差異表達菌群的LDA分析

圖3 83例復發(fā)與非復發(fā)患者糞腸球菌的表達比較

二、糞腸球菌表達量與患者臨床病理特征之間的關系

根據(jù)糞腸球菌的相對表達量的中位數(shù)，本研究將103例患者分為糞腸球菌高豐度組和低豐度組。通過收集所有患者的臨床病例資料，發(fā)現(xiàn)在糞便樣本中糞腸球菌高豐度患者組在淋巴結轉(zhuǎn)移數(shù)目、血管瘤栓、淋巴管瘤栓、神經(jīng)侵犯這四方面數(shù)據(jù)更高。而且，還發(fā)現(xiàn)該組Ⅲ期患者所占的比例也更高（表1）。

表1 糞腸球菌表達量與患者的一般病理特征關系（例）

三、糞腸球菌與患者的生存密切相關

本研究對103例樣本進行生存分析統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)糞便中糞腸球菌豐度更高的患者無復發(fā)生存時間更短（χ2=5.82，P=0.02）（圖4），總生存時間更短（χ2=6.44，P=0.01）（圖5）。

圖4 無復發(fā)生存時間

圖5 總生存時間

討 論

卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑在結直腸癌術后的輔助治療中取得了一定的療效［3］。這種聯(lián)合治療方案對大部分患者在起始階段具有一定的療效，而一部分患者最終會出現(xiàn)復發(fā)［19-20］。復發(fā)患者對于后續(xù)的化療和免疫治療均不敏感［21］。因此，探索復發(fā)相關的分子標志物，篩選藥物治療敏感的患者，具有潛在的臨床意義。

已有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤基因組改變和表觀遺傳改變是腫瘤復發(fā)的分子機制［22-24］。最近基于小鼠模型的研究，顯示腸道微生物能夠調(diào)節(jié)腸道局部免疫反應，進而影響腫瘤對藥物的敏感性［25-26］和免疫治療的療效［9-10］。另外基于人群的研究也顯示腸道微生物可以通過影響適應性免疫，調(diào)節(jié)腫瘤對于化療的敏感性［27］。通過16sRNA測序技術，本研究對復發(fā)患者與非復發(fā)患者的樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)了糞腸球菌在復發(fā)患者的糞便樣本中高度富集。既往研究發(fā)現(xiàn)，菌群是促進腸癌發(fā)展的重要因素。通過宏基因組測序研究發(fā)現(xiàn)，具核梭桿菌可以通過結合宿主細胞表面的E-cadherin蛋白，促進腫瘤細胞的增殖［28］。具核梭桿菌同樣可以誘導LC3II的表達，促進自噬流和自噬小體的形成，增加了結直腸癌的復發(fā)風險［29］。由此可見，腸道菌群在結直腸癌復發(fā)過程中發(fā)揮重要作用。我們的研究提示了糞腸球菌可能在結直腸癌復發(fā)中發(fā)揮作用，因此進一步探索糞腸球菌影響腫瘤復發(fā)的分子機制，有潛在的應用價值。既往研究還發(fā)現(xiàn)，腸道微生物可以作為人類疾病診斷或判斷疾病預后的分子標志物。Jiang等［30］報道了擬桿菌，變形菌，放線菌和厚壁菌與人類抑郁情緒相關。在結直腸癌患者中，腸道具核梭桿菌高豐度患者無復發(fā)生存時間更長［29］。另外的一項研究報道表明，糞便樣本中高豐度具核梭桿菌預測了結直腸癌患者更短的總生存時間［31］。同既往的研究類似，我們的研究也發(fā)現(xiàn)了結直腸腫瘤患者糞便中糞腸球菌的含量與結直腸癌患者的復發(fā)存在一定聯(lián)系，糞便中糞腸球菌豐度高者預后更差。糞腸球菌也是與結腸癌相關的細菌，有研究發(fā)現(xiàn)了在結直腸癌患者糞便中，糞腸球菌豐度更高［32-33］。腸道中的糞腸球菌能夠誘導上皮細胞內(nèi)的超氧化物形成，進而誘導結腸上皮細胞損傷［34-37］。我們的研究結果也說明了糞腸球菌可能是結直腸癌發(fā)展的促進因素之一。與既往研究不同，本研究率先利用復發(fā)患者的糞便樣本，發(fā)現(xiàn)了糞腸球菌可以預測結直腸癌患者術后的復發(fā)。既往的研究還揭示了糞腸球菌能夠破壞結腸上皮細胞的DNA，激活WNT/β-catenin信號通路，誘導調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性［37］。

綜上所述，本研究顯示糞腸球菌與結直腸癌的復發(fā)相關。同時發(fā)現(xiàn)了高富集糞腸球菌的患者總生存時間和無病生存時間更短。這些研究結果顯示了基于糞便樣本的糞腸球菌檢測具有一定的臨床意義，能為結直腸癌復發(fā)的早期診斷提供一些新的策略。同時，通過本研究我們有理由相信糞便樣本中糞腸球菌豐度可能成為未來判斷結直腸癌患者預后新的標志物。