劉 娟，馬藝珈，王 舒，路 暢，楊 陽(yáng)，蔡春波，趙 燕，郭曉紅，曹果清，李步高，高鵬飛

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

隨著生活和消費(fèi)水平的提高，營(yíng)養(yǎng)、綠色的肉品成為人們新的追求[1]。這對(duì)養(yǎng)殖業(yè)提出新的挑戰(zhàn)，風(fēng)味獨(dú)特、瘦肉率高、脂肪含量低、嫩度高等成為肉質(zhì)研究的主題。肌內(nèi)脂肪是形成肉質(zhì)風(fēng)味的重要物質(zhì)，其脂肪酸組成影響著肉類(lèi)營(yíng)養(yǎng)和感官品質(zhì)指標(biāo)[2]。單不飽和脂肪酸的氧化穩(wěn)定性比多不飽和脂肪酸強(qiáng)，能使肉的口感和色澤更好[3]，而多不飽和脂肪酸可以降低人們患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，為了提高豬肉品質(zhì)，研究出人們追求的綠色豬肉，了解脂肪酸代謝機(jī)制非常必要。

脂肪酸代謝機(jī)制一直是國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的研究熱點(diǎn)。研究表明過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome Proliferatorsactivated Receptors γ，PPARγ) 和核 呼 吸 因 子-1(Nuclear Respiratory Factor-1，NRF-1)或核呼吸因子-2(Nuclear Respiratory Factor-2，NRF-2) 能 夠 提高骨骼肌中脂肪酸引起的解偶聯(lián)蛋白1(Uncoupling Protein 1，UCP1)的轉(zhuǎn)錄[5]。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈酰基輔酶A 合成酶1(Acyl-CoA Synthetase 1，ACSL1) 作為線粒體內(nèi)脂肪酸氧化代謝的關(guān)鍵酶，能分解棕色脂肪細(xì)胞中的甘油三酯，產(chǎn)生的脂肪酸在?；o酶A 的作用下進(jìn)入線粒體內(nèi)氧化，激活細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸代謝，同時(shí)調(diào)節(jié)脂肪酸攝取[6]，增加油酸的攝入，提高不飽和脂肪酸的沉積量[7-8]。Lourdes 等發(fā)現(xiàn)胰島素生長(zhǎng)因子2(Insulin Growth Factor 2，IGF2)在不同豬品種間存在g.3072G ＞A 突變，突變后該基因表達(dá)增加，導(dǎo)致多不飽和脂肪酸升高，單不飽和脂肪酸降低，從而影響脂肪酸組成[9]。Dragos 等以硬脂酰輔酶A 去飽和酶1 (Stearoyl-CoA Desaturase 1，SCD1)基因敲除小鼠為研究對(duì)象，分析SCD1 在脂肪酸代謝過(guò)程中的作用，發(fā)現(xiàn)SCD1 能夠減少小鼠白色脂肪組織中脂肪酸再酯化，影響甘油生成和脂肪分解[10]。肝臟型肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(Carnitine Palmitoyl Transferase 1，CPT1A)是長(zhǎng)鏈脂肪酸β 氧化的限速酶，可以催化長(zhǎng)鏈脂肪酸從?；o酶A轉(zhuǎn)化為?；舛緣A，使長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體內(nèi)氧化[11]，加速脂肪酸分解，減少體內(nèi)脂肪含量[12]。

研究團(tuán)隊(duì)前期分析發(fā)現(xiàn)ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7、NDUFV1 和PSTPIP2 在豬脂肪酸代謝中具有重要作用[13]。本研究以大白豬和馬身豬為研究對(duì)象，利用qRT-PCR 技術(shù)分析6 個(gè)基因在豬肌肉發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化及組織表達(dá)譜，基于這6 個(gè)基因的氨基酸序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，初步分析這6 個(gè)基因在豬脂肪酸代謝過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律和作用，為豬脂肪酸代謝的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

于1 日齡、30 日齡、60 日齡、90 日齡、120 日齡、150 日齡和180 日齡分別隨機(jī)選擇3 頭體重相近的馬身豬和大白豬，采集心、肝、脾、腎、脂肪、小腸、背最長(zhǎng)肌和股二頭肌，于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

TRIzol Reagent (Life Technologies公 司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green RT-PCR 試劑盒(TaKaRa 公司)；乙醇、氯仿、異丙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和合成

參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中豬ATP5A1(N M _ 0 0 1 1 8 5 1 4 2 .1)、N D U F A B1(NM_001167652.1)、CPOX(NM_001243844.1)、N D U F B7(X M_0 0 3 4 8 0 7 7 5.4)、N D U F V1(X M _ 0 0 3 1 2 2 4 3 8 .5)、P S T P I P2(X M_0 2 1 0 9 2 5 3 3.1) 和 1 8 S r R N A(NW_018085108.1) 序 列，其 中18S rRNA 為內(nèi)參基因。使用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.2 總RNA 提取和cDNA 合成

TRIzol Reagent 提 取 總RNA 后，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用核酸蛋白測(cè)定儀(ND-2000，Nanodrop，USA) 測(cè) 定 總RNA 的 純度和濃度。將得到的RNA 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，－20 ℃保存。

1.2.3 qRT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá)

采用qRT-PCR 檢測(cè)6 個(gè)基因表達(dá)，每個(gè)樣本設(shè)3 個(gè)重復(fù)，反應(yīng)程序如下：預(yù)變性階段，95 ℃ 30 s；循環(huán)階段，95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，45 個(gè)循環(huán)；溶解階段，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(http：//plants.ensembl.org/index.html)獲取9 個(gè)物種(豬、山羊、牛、人、獼猴、雞、綠頭鴨、大鼠、小鼠)ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7、NDUFV1和PSTPIP2 的氨基酸序列。使用Clustal W 2.0(http://www.clustal.org/clustal2/)[14]將6 個(gè)基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。利用MEGA 7.0(https://www.megasoftware.net/) 的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，使用Bootstrap 法進(jìn)行1 000 次可信度檢測(cè)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，采用t檢驗(yàn)分析基因在不同日齡間的表達(dá)差異，單因素方差分析基因在不同組織中的表達(dá)差異，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 基因在不同日齡的表達(dá)分析

在馬身豬中，ATP5A1、NDUFAB1、CPOX和NDUFB7 在1 日齡表達(dá)量最高，90 日齡表達(dá)量逐漸降低；NDUFV1 和PSTPIP2 在1 日齡表達(dá)量最低，NDUFV1 在180 日齡表達(dá)量最高，PSTPIP2在120 日齡表達(dá)量最高，180 日齡有降低的趨勢(shì)。在大白豬中，ATP5A1 和NDUFV1 在1 日齡時(shí)表達(dá)量最高，然后逐漸降低，180 日齡表達(dá)量最低；NDUFAB1、CPOX和NDUFB7 在1 日齡表達(dá)量最高，90 日齡表達(dá)量最低，180 日齡表達(dá)量有升高趨勢(shì)；PSTPIP2 在1 日齡表達(dá)量最低，隨著日齡增長(zhǎng)表達(dá)量逐漸升高，180 日齡表達(dá)量最高。見(jiàn)圖1。

兩品種間比較發(fā)現(xiàn)，大白豬ATP5A1 的表達(dá)量在30 日齡和60 日齡顯著高于馬身豬，在120 日齡、150 日齡和180 日齡極顯著低于馬身豬；馬身豬NDUFAB1 的表達(dá)量在30 日齡顯著高于大白豬，在120 日齡、150 日齡和180 日齡極顯著低于大白豬；大白豬CPOX和NDUFB7 的表達(dá)量在120 日齡、150 日齡和180 日齡極顯著高于馬身豬；NDUFV1 的表達(dá)量在各個(gè)日齡(不包括90 日齡) 均有差異，大白豬在1 日齡、30 日齡和60 日齡較高，馬身豬在120 日齡、150 日齡和180 日齡較高；大白豬PSTPIP2 的表達(dá)量在60 日齡、120 日齡和180 日齡顯著高于馬身豬，在150 日齡極顯著高于馬身豬。

2.2 基因在不同組織的表達(dá)分析

6 個(gè)基因在馬身豬不同組織中均有表達(dá)，在脂肪中的表達(dá)量均極顯著高于其他組織。ATP5A1、NDUFV1、NDUFAB1 和NDUFB7 在肝和脾中的表達(dá)量?jī)H次于脂肪，接下來(lái)是小腸、腎和肌肉，在心臟中的表達(dá)量最低；CPOX在肌肉中的表達(dá)量?jī)H次于脂肪，接下來(lái)是脾、心、小腸和腎，在肝中的表達(dá)量最低；PSTPIP2 在肝、腎、心臟中的表達(dá)量極顯著低于脂肪，脾臟中的表達(dá)量極顯著低于肌肉。見(jiàn)圖2。

2.3 豬與其他物種進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

將豬6 個(gè)基因的氨基酸序列與其他物種比較發(fā)現(xiàn)(表2)，6 個(gè)基因均較保守，豬與山羊、牛的同源性最高，為99.95%，與人的同源性為99.94%，與獼猴的同源性為99.93%，與雞和綠頭鴨的同源性最低，為99.8%。

根據(jù)6 個(gè)基因氨基酸序列在不同物種之間的同源性比較結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。如圖3 顯示，聚類(lèi)數(shù)主要分為4 個(gè)分支，其中山羊和牛組成反芻動(dòng)物分支，再和豬聚在一起，人和獼猴組成靈長(zhǎng)類(lèi)分支，大鼠和小鼠組成嚙齒類(lèi)動(dòng)物分支，最后雞和綠頭鴨組成禽類(lèi)分支。禽類(lèi)分支與其他分支距離最遠(yuǎn)。豬6 個(gè)基因的氨基酸序列與牛和山羊的親緣關(guān)系較近，其次是人和獼猴，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是綠頭鴨和雞。

3 討論

肌內(nèi)脂肪含量和脂肪酸組成可直接影響豬肉品質(zhì)，尤其是肉的風(fēng)味、嫩度、多汁性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。脂肪酸是肌內(nèi)脂肪的物質(zhì)前提，肉質(zhì)是脂肪酸和肌內(nèi)脂肪的體現(xiàn)。在脂肪酸中，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸有較好的感官特性和工藝特性，主要影響肉質(zhì)風(fēng)味，而多不飽和脂肪酸具有較好的營(yíng)養(yǎng)特性，影響肉質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[15]。油酸(C18 ∶1) 是豬肉中含量最豐富的脂肪酸，可以作為改善豬肉感官和營(yíng)養(yǎng)特性的重要指標(biāo)[16]。

研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)前期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析獲得了一系列影響肌肉中脂肪酸代謝的基因，其中ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7、NDUFV1和PSTPIP2 在不同類(lèi)型豬肌內(nèi)脂肪中的表達(dá)量差異最顯著[13]。ATP5A1 是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，經(jīng)常用作線粒體復(fù)合物的標(biāo)記。線粒體中的二肽重復(fù)蛋白Poly(GR) 通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑增加了ATP5A1 的泛素化及其降解[17]。楊素麗等利用免疫組化方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大腸癌中的ATP5A1 比相應(yīng)癌旁組織的明顯上調(diào)[18]。其他研究還驗(yàn)證了ATP5A1 在腫瘤發(fā)病機(jī)制中起重要作用，可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤磷酸化與人類(lèi)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的發(fā)展相關(guān)聯(lián)[19]。NDUFAB1作為線粒體代謝的新型增強(qiáng)劑，通過(guò)協(xié)同增強(qiáng)線粒體脂肪酸合成途徑介導(dǎo)脂酰化和丙酮酸脫氫酶的活化，增加呼吸復(fù)合體和超復(fù)合體的組裝，防止脂肪沉積過(guò)高而導(dǎo)致肥胖和胰島素抵抗[20]。CPOX蛋白包含許多還原的硫醇?xì)埢?，可催化血紅素生物合成途徑中的卟啉原-Ⅲ向原卟啉原-Ⅸ的兩步脫羧反應(yīng)，CPOX4 缺失可導(dǎo)致血紅素生物合成受損[21]。NDUFB7 位于泛醌氧化還原酶復(fù)合物Ⅰ的膜間表面[22]，在線粒體活動(dòng)供能方面起重要作用。NDUFV1 和NDUFV2 是涉及氧化應(yīng)激和ATP 產(chǎn)生的兩個(gè)重要亞基[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，NDUFV1 可為母豬腹中胎兒發(fā)育提供能量[24]。PSTPIP2 是一種與自身炎性疾病相關(guān)的蛋白，它參與巨噬細(xì)胞的活化、嗜中性粒細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和破骨細(xì)胞的分化等[25]。

Linn 等對(duì)來(lái)自95 個(gè)人的27 個(gè)不同組織樣本進(jìn)行RNA 測(cè)序發(fā)現(xiàn)，ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7 在心臟、腎、脂肪等組織中均有表達(dá)，其中ATP5A1、NDUFAB1 在心臟中的表達(dá)量最高，CPOX在骨髓中的表達(dá)量最高，NDUFB7 在脂肪中的表達(dá)量最高[26]。本研究中，ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7 在兩個(gè)品種豬的不同日齡均有表達(dá)，且隨著日齡增長(zhǎng)表達(dá)量逐漸降低，在發(fā)育初期表達(dá)量較高。ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7 在 脂 肪 中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他組織，表明4 個(gè)基因可能在豬發(fā)育初期的脂肪酸代謝過(guò)程中有重要作用，可為仔豬生長(zhǎng)發(fā)育提供能量。Linn 等發(fā)現(xiàn)，NDUFV1 在人類(lèi)25 個(gè)組織中均有表達(dá)，在心臟中表達(dá)量最高[26]。本研究中，NDUFV1 在脂肪中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他組織，表明在豬的發(fā)育過(guò)程中NDUFV1 能夠促進(jìn)脂肪沉積。PSTPIP2 在人類(lèi)17 個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在骨髓中的表達(dá)量最高[26]。本研究也發(fā)現(xiàn)PSTPIP2 在脂肪中的相對(duì)表達(dá)量最高，提示PSTPIP2 可能在豬的發(fā)育后期對(duì)脂肪沉積起作用。

本研究對(duì)影響豬肌內(nèi)脂肪沉積與脂肪酸組成關(guān)鍵基因的表達(dá)特征進(jìn)行分析，初步證明這些基因通過(guò)影響肌肉中脂肪酸的合成代謝可為機(jī)體提供能量，進(jìn)而影響豬肉品質(zhì)。本研究結(jié)果可為深入研究豬脂肪酸代謝機(jī)制提供理論依據(jù)，為探索豬脂肪酸對(duì)肉質(zhì)性狀影響提供參考。

參考文獻(xiàn)：(26 篇，略)