李林煜，陳 燁，甘 平

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng)550000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng)550004)

腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是一種治療終末期腎病(End-stage renal disease，ESRD)經(jīng)濟(jì)有效的腎臟替代療法[1]。但腹膜組織長(zhǎng)期暴露于生物不相容的高葡萄糖PD液(PDF)會(huì)使腹膜進(jìn)行性損傷，導(dǎo)致腹膜纖維化[2]。目前腹膜纖維化的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，尚無(wú)有效的治療方法。關(guān)于腹膜纖維化的發(fā)病機(jī)制中醫(yī)學(xué)目前沒(méi)有相關(guān)的描述，但一些醫(yī)學(xué)家認(rèn)為腹膜纖維化的中醫(yī)發(fā)病機(jī)制為脾腎虧虛、痰瘀互結(jié)等。研究顯示淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物，是一種傳統(tǒng)中草藥，具有增強(qiáng)人體免疫功能、延緩衰老、防治神經(jīng)性疾病等作用，淫羊藿素是從淫羊藿中提取的一種異戊二烯類(lèi)黃酮衍生物，具有抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等作用[3]。目前尚不了解淫羊藿素在透析誘導(dǎo)的腹膜纖維化中的抗纖維化作用。β連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)在體內(nèi)自我更新中發(fā)揮重要作用，在腎臟纖維化、肺纖維化、肝纖維化和皮膚纖維化中涉及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的啟動(dòng)[4-6]。糖原合酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)在上述病理中抑制β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[7]。由此，本研究擬探討淫羊藿素對(duì)腹膜纖維化的作用效果及對(duì)GSK-3β、β-catenin的影響，為淫羊藿素治療腹膜纖維化的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:成年雄性SPF級(jí)SD大鼠30只，體重(210±10)g。購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，使用許可證號(hào)：SCXK(川)2019-031。飼養(yǎng)于恒溫(20～25 ℃)、恒濕(50±5)%環(huán)境中，自然采光，自由飲水。

1.1.2 主要試劑及儀器:淫羊藿素購(gòu)自上海友思生物技術(shù)公司；0.1%葡萄糖氯已定購(gòu)于美國(guó)Sigma；蘇木素染液(批號(hào)：C200301)、伊紅染液(批號(hào)：C200403)購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；改良Masson三色染色液(批號(hào)：0630A20)購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；GSK-3β、β-Catenin ELISA試劑盒購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司；相關(guān)一抗GSK-3β、β-catenin、p-GSK-3β購(gòu)自CST，二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；RS36型全自動(dòng)染色機(jī)購(gòu)自常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備公司；病理組織漂烘儀(PHY-Ⅲ型)購(gòu)自常州市中威電子儀器；BA210Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡購(gòu)自麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腹膜纖維化大鼠模型構(gòu)建及干預(yù)方法:大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為假手術(shù)組(10只)及造模組(20只)。模型組每日給予0.1%葡萄糖氯已定(1 ml/100 g)腹腔注射，假手術(shù)組每日給予1 ml生理鹽水腹腔注射，連續(xù)21 d。21 d后造模大鼠隨機(jī)分為模型組、淫羊藿素組，隨后假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，淫羊藿素組按3 mg/kg淫羊藿素灌胃，淫羊藿素劑量選擇是根據(jù)前期體內(nèi)淫羊藿素(0.1～10 mg/kg)處理的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用3 mg/kg劑量給藥，每天給藥1次，持續(xù)6周。

1.2.2 標(biāo)本采集:三組大鼠于末次給藥結(jié)束24 h后，處死大鼠，分別取腹膜組織，將腹膜組織分為三部分，一部分采用4%多聚甲醛固定，用于病理觀察及免疫組化染色；另一部分于-80 ℃冰箱保存，用于ELISA檢測(cè)；剩余部分于液氮中保存，用于后續(xù)Western blot檢測(cè)。

1.2.3 腹膜組織病理變化觀察:HE染色方法為，腹膜組織4%多聚甲醛固定，包埋在石蠟中，然后切成切片(約5 μm厚)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品進(jìn)行了蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察腹膜組織的病理變化，并用光學(xué)顯微鏡拍照。Masson染色：腹膜組織4%多聚甲醛固定，包埋在石蠟中，切成5 μm的橫截面，使用Masson的三色染色劑，將腹膜組織分別染成紅色和藍(lán)色，觀察腹膜組織膠原纖維變化，并用光學(xué)顯微鏡拍照。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法:固定的腹膜組織脫水，包埋，切片，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)中的0.3%過(guò)氧化氫抑制這些切片中的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，并用10%的正常山羊血清封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。然后將切片與抗GSK-3β、抗β-catenin抗體4 ℃過(guò)夜，后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgGs二抗37 ℃孵育30 min，蘇木素染色，鏡檢觀察，并使用Image-J圖像分析軟件根據(jù)積分光密度(IOD)/面積值確定GSK-3β、β-catenin陽(yáng)性染色的強(qiáng)度。

1.2.5 ELISA檢測(cè):取腹膜組織，剪碎后加入預(yù)冷的生理鹽水3 ml，4 ℃下研磨，3500 r/min低溫離心10 min，取上清液，用于分析GSK-3β、β-catenin含量。通過(guò)相應(yīng)的ELISA分析試劑盒檢測(cè)，所有步驟均按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔，其中空白孔不加樣品，只加顯色劑A、B和終止液用于調(diào)零；標(biāo)準(zhǔn)品孔加入配好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，然后加入辣根過(guò)氧化物酶100 μl；待測(cè)樣品孔加入樣本50 μl，然后辣根過(guò)氧化物酶100 μl，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育60 min。揭膜，棄去液體，于每孔加滿洗滌液后靜置1 min，棄去液體，重復(fù)5次。每孔先加入底物液A 50 μl，再加入底物液B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)。在15 min內(nèi)，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。

1.2.6 Western blot分析:將每個(gè)樣品在裂解緩沖液中裂解以獲得總蛋白質(zhì)，然后通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離該蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在5%脫脂牛奶中封閉60 min后，將膜與一抗GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、β-actin在4 ℃孵育過(guò)夜。然后將膜用tris緩沖鹽水Tween(TBST)洗滌，并與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗兔或抗小鼠二抗在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑觀察蛋白條帶，并使用Image-J軟件通過(guò)光密度法定量。條帶的灰度值標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin，并表示為相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腹膜組織病理變化 假手術(shù)組：腹膜組織結(jié)構(gòu)較為完整、清晰，未見(jiàn)明顯增厚；表面被覆單層扁平上皮，排列較為整齊，間皮下可見(jiàn)疏松結(jié)締組織，未見(jiàn)明顯纖維增生或炎細(xì)胞浸潤(rùn)；腹膜下肌束結(jié)構(gòu)清晰，肌束內(nèi)肌細(xì)胞呈長(zhǎng)圓柱狀，胞核呈扁圓形或橢圓形，位于細(xì)胞周緣，胞質(zhì)染色較為均勻，未見(jiàn)明顯變性壞死。模型組：腹膜組織明顯增厚，間皮細(xì)胞排列紊亂；間皮下大量纖維組織增生，膠原纖維增多，腹膜組織厚度增加，增生纖維組織較為致密，平行排列成束，成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞穿插于纖維束間，增生區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)大量血管增生及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，局部血管充血擴(kuò)張較為明顯；腹膜下肌細(xì)胞變性壞死，見(jiàn)肌細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)丟失，大量肌細(xì)胞萎縮溶解。淫羊藿素組：腹膜組織增厚，纖維組織不同程度增生，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞或淋巴細(xì)胞聚集于新生纖維束間；腹膜下部分肌細(xì)胞變性，見(jiàn)肌細(xì)胞輕微萎縮，腹膜組織間皮下致密層增厚程度減輕，膠原纖維較模型組減少(圖1)。

圖1 各組大鼠腹膜組織病理變化(×400)

2.2 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)比較 見(jiàn)表1(圖2)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin蛋白含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，淫羊藿素組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin蛋白含量明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)比較

圖2 各組大鼠GSK-3β、β-catenin免疫組化染色圖(IHC染色，×200)

2.3 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin含量比較 見(jiàn)表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，淫羊藿素組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin水平明顯降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin含量比較

2.4 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)比較 見(jiàn)表3(圖3)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腹膜組織中GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，淫羊藿素組大鼠腹膜組織中GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)比較

圖3 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)

3 討 論

腹膜纖維化是長(zhǎng)期腹膜透析(PD)引起的嚴(yán)重并發(fā)癥，其特征是間皮細(xì)胞丟失和細(xì)胞外基質(zhì)沉積[8]，因此開(kāi)發(fā)腹膜纖維化的潛在治療策略尤為重要。中醫(yī)認(rèn)為腹膜纖維化的發(fā)病機(jī)制為脾腎虧虛、痰瘀互結(jié)、久病入絡(luò)，從而導(dǎo)致腹絡(luò)微型癥積。

淫羊藿(Epimedium brevicomu Maxim.)又名仙靈脾、陰陽(yáng)活、銅絲草、巴倫草，味甘、辛，性溫，歸腎、肝經(jīng)，《玉楸藥解》注其功效：“榮筋強(qiáng)骨，起痿壯陽(yáng)，溫補(bǔ)肝腎，滋益精血，治陰絕不生，陽(yáng)痿不舉，消瘰疬，起癱瘓，益志寧神，清風(fēng)明目”[9]。《本草綱目》認(rèn)為淫羊藿有“益精氣，堅(jiān)筋骨，補(bǔ)腰膝，強(qiáng)心力”之功效，對(duì)于腎陽(yáng)虛導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥療效顯著。因此，淫羊藿也被廣泛用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[10]。淫羊藿最早記載見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，藥理作用有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)除濕等，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明淫羊藿素已被臨床證明對(duì)一系列腫瘤、骨質(zhì)疏松等疾病有效，此外，在神經(jīng)保護(hù)、心臟保護(hù)、抗炎、抗肝纖維化等方面具有顯著藥理作用[11]。研究報(bào)道淫羊藿素可顯著抑制血清促炎細(xì)胞因子的分泌和產(chǎn)生，包括前列腺轉(zhuǎn)腺癌小鼠中的白細(xì)胞介素(IL-1α、IL-β、IL-6)和腫瘤壞死因子TNF-α[12]。此外，淫羊藿素還可通過(guò)激活5’-單磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMPK)并抑制β位點(diǎn)APP裂解酶1(BACE-1)發(fā)揮抗阿爾茨海默氏癥作用[13]。Zhao等[14]發(fā)現(xiàn)淫羊藿素通過(guò)抑制IL-6和TNF-α的表達(dá)并通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)通路抑制肺癌破骨細(xì)胞的形成。Hwang等[15]報(bào)道淫羊藿素可通過(guò)刺激Nrf2/ARE和降低AP-1和NF-κB信號(hào)通路恢復(fù)UVB誘導(dǎo)的光老化。淫羊藿素還可調(diào)節(jié)硬化素的表達(dá)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨[16]。但淫羊藿素對(duì)腹膜纖維化的保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究建立腹膜纖維化大鼠，觀察淫羊藿素抗纖維化作用。首先從病理角度觀察結(jié)果顯示淫羊藿素可減輕腹膜增厚，減輕間皮下大量纖維組織增生，改善局部血管充血擴(kuò)張，并減少腹膜組織膠原纖維。提示淫羊藿素對(duì)腹膜纖維化具有改善作用，可成為治療腹膜纖維化的潛在治療藥物。

淫羊藿素已被表明可通過(guò)多靶點(diǎn)，多途徑作用于各種疾病[11]。研究報(bào)道GSK-3β是Wnt信號(hào)通路中的重要信號(hào)因子，在各種細(xì)胞內(nèi)均廣泛存在，可通過(guò)Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖和凋亡等多種進(jìn)程[17]。Zhang等[18]證實(shí)GSK-3β在纖維化中占有重要作用，抑制GSK-3β的表達(dá)可以抑制肺纖維化的發(fā)生與進(jìn)展，并提出GSK-3β可能是肺纖維化治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。β-catenin是通過(guò)Axin、腺瘤性息肉病大腸桿菌、酪蛋白激酶1α(CK1α)和GSK-3β組成的破壞復(fù)合體維持在較低水平，GSK-3β磷酸化抑制破壞復(fù)合物的泛素化活性，導(dǎo)致胞內(nèi)β-catenin的積聚，隨后遷移到細(xì)胞核[19]。核β-catenin與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子結(jié)合因子(TCF/LEF)家族成員形成復(fù)合物，刺激靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括Snail、Twist、纖維連接蛋白(fibronectin)、MMPs、Jagged1和LEF1，促進(jìn)細(xì)胞增殖[20]。研究表明抑制β-catenin可阻斷高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[21]。Yan等[22]研究表明β-catenin通路可能在高糖誘導(dǎo)的腹膜纖維化過(guò)程中促進(jìn)腹膜間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究表明，淫羊藿素可抑制葡糖糖氯已定誘導(dǎo)的腹膜纖維化大鼠GSK-3β、β-catenin表達(dá)，提示淫羊藿素可能通過(guò)抑制GSK-3β的磷酸化，促進(jìn)GSK-3β降解，減少β-catenin蓄積，減輕腹膜纖維化。

綜上所述，淫羊藿素通過(guò)減輕腹膜增厚及腹膜組織膠原纖維進(jìn)展，抑制GSK-3β/β-catenin軸的激活，減輕葡糖糖氯已定誘導(dǎo)的腹膜纖維化。