陳賢家，符士穎，蔡翠珠，呂迎春

(1.儋州市中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科，海南 儋州 571700;2.三亞市中醫(yī)院脾胃科，海南 三亞 572000)

腸易激綜合征是一組持續(xù)或間歇發(fā)作，以腹痛、腹脹、排便習(xí)慣和(或)大便性狀改變?yōu)榕R床表現(xiàn)，而缺乏胃腸道結(jié)構(gòu)和生化異常的腸道功能紊亂性疾病[1]。大多數(shù)報(bào)道都集中在胃腸蠕動(dòng)障礙或遠(yuǎn)端結(jié)腸的內(nèi)臟超敏反應(yīng)。此外，研究表明，腸易激綜合征大鼠的腸道通透性增加[2-3]。核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)/Notch1通路在腸易激綜合征期間調(diào)節(jié)腸通透性，其作為腸緊密連接蛋白的有效調(diào)節(jié)細(xì)胞因子[4-5]。有報(bào)道稱腸易激綜合征是由應(yīng)激誘導(dǎo)的腦-腸軸變化引起的，導(dǎo)致腸道通透性過高，從而加劇黏膜下異常免疫反應(yīng)[6]。然而，尚不清楚導(dǎo)致腸易激綜合征腸黏膜屏障功能受損的確切病理生理信號(hào)。和調(diào)健脾方是中藥的經(jīng)典處方之一。它由多種中藥組成：炒柴胡、炒白芍、炒白術(shù)、炒黨參、廣木香、炒陳皮、佛手片、廣藿香、焦薏苡仁、干荷葉、淡干姜。目前尚未見關(guān)于和調(diào)健脾方治療腸易激綜合征動(dòng)物模型以探討其藥效學(xué)和機(jī)制的文獻(xiàn)。本研究擬探討和調(diào)健脾方對(duì)腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠的治療作用及NF-κB/Notch1通路的影響，為腹瀉型腸易激綜合征的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雌雄不限，10周齡，體重260～280 g，購自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2018-0001，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2018-0004，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SD203671，大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度(22～26 ℃)、光照(12 h∶12 h光照-黑暗循環(huán))、濕度60%～70%。

1.2 主要藥物、試劑與儀器 和調(diào)健脾方成分為：炒柴胡、炒黨參各18 g，炒白芍12 g，炒白術(shù)、佛手片、焦薏苡仁、干荷葉各9 g，廣藿香6 g，炒陳皮4.5 g，廣木香、淡干姜各3 g(以上中藥材均購自四川國(guó)強(qiáng)中藥飲片有限公司)，以上中藥煎煮2次，每次1 h，混合2次藥液，過濾，濃縮成生藥濃度為0.282、0.564 g/ml的湯劑；番瀉葉(批號(hào) 301876)；匹維溴銨片(規(guī)格50 mg/片，批號(hào)：20200402)；白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、二胺氧化酶(Diamine oxidase，DAO)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海佰曄生物科技中心，批號(hào)分別為：CP-3012R、CP-4007、CP-5116)；蘇木精-伊紅(Hematoxylin eosin，HE)染色試劑盒、放射免疫沉淀緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)分別為：DP1063、DP3315)；TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：15547012)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司，批號(hào)：RR117)；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司，批號(hào)：WE85532)；BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Pierce公司，批號(hào)：XC59963.32)；NF-κB單克隆抗體、Notch1單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體、山羊抗鼠二抗(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為：ab40754、ab31108、ab39005、ab10018)；增強(qiáng)的ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Pierce公司，批號(hào)：SD-306D)。酶標(biāo)儀(山東恒美電子科技有限公司，型號(hào)：HM-SY96A)；顯微鏡(日本尼康公司，型號(hào)：E200 POL)；實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：CFX96Touch)；凝膠成像儀(北京君意華鑫科技有限公司，型號(hào)：JY-Clear ECL)。

1.3 造模及分組 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，參照文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行腹瀉型腸易激綜合征造模，將大鼠給予番瀉葉水煎液(濃度0.3 g/ml)灌胃，灌胃體積10 ml/kg，每天灌胃1次，每次灌胃后1 h，用繩子將大鼠四肢束縛1 h，再將大鼠放入冷水池中刺激30 min，連續(xù)兩周。當(dāng)大鼠出現(xiàn)體重減輕，排稀便，精神萎靡不振，食欲減退，倦怠少動(dòng)等癥狀，則表示造模成功[7]。將造模成功的48只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組、匹維溴銨組、和調(diào)健脾方低劑量組、和調(diào)健脾方高劑量組，每組12只；另取12只健康大鼠作為對(duì)照組，對(duì)照組大鼠每天灌胃10 ml/kg的蒸餾水。

1.4 給 藥 造模成功后第1天，匹維溴銨組大鼠給予2 mg/kg匹維溴銨[8]灌胃(匹維溴銨與蒸餾水配制成濃度為0.2 mg/ml的溶液，灌胃體積10 ml/kg)，和調(diào)健脾方低劑量組、和調(diào)健脾方高劑量組大鼠分別給予2.82、5.64g/kg和調(diào)健脾方[9]灌胃(濃度分別為0.282、0.564 g/ml的生藥，灌胃體積10 ml/kg)，對(duì)照組和模型組大鼠灌胃等體積蒸餾水，每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 大鼠排便頻率、糞便含水量的測(cè)定：給藥周期結(jié)束后，將大鼠放在籠中24 h，自由進(jìn)食和飲水，計(jì)算大鼠每小時(shí)的平均排便次數(shù)作為排便頻率。收集糞便顆粒進(jìn)行稱重(m0)，然后將糞便顆粒在烤箱中干燥后再次稱重(m1)，計(jì)算糞便含水量，糞便含水量=(m0-m1)/m0×100%。

1.5.2 大鼠血清IL-2、TNF-α、DAO水平的測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠尾靜脈采血，3000 r/min離心分離血清，采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清IL-2、TNF-α、DAO水平。

1.5.3 大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察：頸脫臼處死大鼠，獲取結(jié)腸組織，用生理鹽水沖洗并在4%多聚甲醛中固定過夜，然后用連續(xù)的脫水步驟處理結(jié)腸組織，并包埋在石蠟塊中，將結(jié)腸組織切成薄片并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)HE染色，從每組中選擇3個(gè)樣本，并從每個(gè)樣本中選擇4個(gè)區(qū)域觀察，以評(píng)估黏膜層的腸黏膜屏障完整性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.5.4 大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1 mRNA水平的測(cè)定：用TRIzol試劑提取結(jié)腸組織總RNA，對(duì)于總RNA逆轉(zhuǎn)錄，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將500 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，基因表達(dá)通過SYBR Green熒光定量PCR試劑盒在實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)上操作。將NF-κB、Notch1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH表達(dá)，使用2-△△Ct方法計(jì)算mRNA表達(dá)的相對(duì)倍數(shù)變化。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，引物序列如下：NF-κB為(正向)5’-ACACCAGACCGCAGCTCCATCAAGT-3’和(反向)5’-TCCATTGCTGCTGTCTGATTTGTAG-3’；Notch1為(正向)5’-TGTACGTGAAGCATGCCGTGACT-3’和(反向)5’-GGTGACGTGATTTTCTGTTCGTA-3’；GAPDH為(正向)5’-GCCAGTGGACTCCACGACTGGA-3’和(反向)5’-CAACTACATGGTTTACATGTTC-3’。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)至少3遍。PCR擴(kuò)增條件如下：95 ℃持續(xù)10 min，然后進(jìn)行40個(gè)95 ℃持續(xù)10 s和60 ℃持續(xù)30 s的循環(huán)。

1.5.5 大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1蛋白水平的測(cè)定：將結(jié)腸組織在放射免疫沉淀緩沖液中裂解，收集蛋白質(zhì)并使用BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量，用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離40 μg蛋白質(zhì)樣品，并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，將膜在5%脫脂牛奶中室溫下封閉1 h。加入NF-κB(1∶1000)、Notch(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)單克隆抗體與膜在4 ℃孵育過夜，然后將膜用PBS緩沖液洗滌3次，并與山羊抗鼠二抗(1∶5000)在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)的ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯示蛋白印跡，通過使用凝膠成像儀對(duì)條帶的強(qiáng)度進(jìn)行定量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠排便頻率、糞便含水量比較 見表1。與對(duì)照組比較，模型組大鼠排便頻率、糞便含水量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，匹維溴銨組、和調(diào)健脾方低劑量組、和調(diào)健脾方高劑量組大鼠排便頻率、糞便含水量降低(P<0.05)；且和調(diào)健脾方高劑量組大鼠排便頻率、糞便含水量低于和調(diào)健脾方低劑量組(P<0.05)；和調(diào)健脾方高劑量組大鼠排便頻率、糞便含水量與匹維溴銨組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠排便頻率、糞便含水量比較

2.2 各組大鼠血清IL-2、TNF-α、DAO水平比較 見表2。與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-2、TNF-α、DAO水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，匹維溴銨組、和調(diào)健脾方低劑量組、和調(diào)健脾方高劑量組大鼠血清IL-2、TNF-α、DAO水平降低(P<0.05)；且和調(diào)健脾方高劑量組大鼠血清IL-2、TNF-α、DAO水平低于和調(diào)健脾方低劑量組(P<0.05)；和調(diào)健脾方高劑量組大鼠血清IL-2、TNF-α、DAO水平與匹維溴銨組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠血清IL-2、TNF-α、DAO水平比較

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織病理觀察 對(duì)照組結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)正常；模型組腸絨毛變短、增厚、脫落，腸黏膜上皮細(xì)胞脫落，可見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；匹維溴銨組及和調(diào)健脾方高劑量組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞脫落減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；和調(diào)健脾方低劑量組仍可見明顯充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。

A：對(duì)照組;B：模型組;C：匹維溴銨組；D：和調(diào)健脾方低劑量組；E：和調(diào)健脾方高劑量組圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理結(jié)構(gòu)觀察(HE染色，×400)

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 見表3。與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，匹維溴銨組、和調(diào)健脾方低劑量組、和調(diào)健脾方高劑量組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；且和調(diào)健脾方高劑量組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1 mRNA表達(dá)水平低于和調(diào)健脾方低劑量組(P<0.05)；和調(diào)健脾方高劑量組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1 mRNA表達(dá)水平與匹維溴銨組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 見表4(圖2)。與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，匹維溴銨組、和調(diào)健脾方低劑量組、和調(diào)健脾方高劑量組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；且和調(diào)健脾方高劑量組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1蛋白表達(dá)水平低于和調(diào)健脾方低劑量組(P<0.05)；和調(diào)健脾方高劑量組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1蛋白表達(dá)水平與匹維溴銨組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

A：對(duì)照組；B：模型組；C：匹維溴銨組；D：和調(diào)健脾方低劑量組；E：和調(diào)健脾方高劑量組圖2 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1蛋白電泳圖

3 討 論

腸易激綜合征呈持續(xù)或間歇發(fā)作，是一種缺乏胃腸道結(jié)構(gòu)和生化異常的腸道功能紊亂性疾病。近年來，有關(guān)腸易激綜合征的相關(guān)研究越來越多，然而，腸易激綜合征的確切病理機(jī)制仍不清楚，心理和壓力因素被認(rèn)為是影響腸易激綜合征的重要因素[10]。另外，越來越多的學(xué)者認(rèn)識(shí)到低度炎癥在繼發(fā)性腸易激綜合征中起重要作用[11]。作為天然的物理屏障，結(jié)腸上皮細(xì)胞在防止細(xì)菌、病原體和其他抗原侵入腸道黏膜中起著重要的保護(hù)作用。腸道屏障的完整性穩(wěn)定了整個(gè)腸道生態(tài)系統(tǒng)[12]。已經(jīng)證明，腸黏膜屏障功能破壞是腸易激綜合征的重要致病因素[13]。因此，恢復(fù)腸黏膜屏障功能可能是腸易激綜合征治療的新目標(biāo)。

和調(diào)健脾方是著名的中藥處方之一，可以有效緩解腹痛和腹瀉，恢復(fù)患者體內(nèi)消化道的平衡。和調(diào)健脾方中的23種成分已被成功驗(yàn)證，包括單萜糖苷、色酮、內(nèi)酯、有機(jī)酸類黃酮和甾類化合物等[9]。然而，關(guān)于和調(diào)健脾方在腹瀉型腸易激綜合征治療中的藥理作用和機(jī)制的研究仍然很有限。因此，本研究旨在探討腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中和調(diào)健脾方的治療機(jī)制，并進(jìn)一步研究和調(diào)健脾方對(duì)腸黏膜屏障的保護(hù)作用及其機(jī)制。在本項(xiàng)研究中，模型組大鼠排便頻率、糞便含水量、血清IL-2、TNF-α、DAO明顯高于對(duì)照組；和調(diào)健脾方低、高劑量組大鼠排便頻率、糞便含水量、血清IL-2、TNF-α、DAO低于模型組。這說明，腹瀉型腸易激綜合征大鼠血清炎癥因子水平較高，并伴有高糞便含水量和高排便頻率，用和調(diào)健脾方治療后，腹瀉型腸易激綜合征大鼠的糞便含水量、排便頻率和血清炎癥因子水平降低，腸蠕動(dòng)頻率減少，表明腸通透性降低。此外結(jié)合本研究病理結(jié)果，匹維溴銨組及和調(diào)健脾方高劑量組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞脫落減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，說明和調(diào)健脾方可減輕結(jié)腸黏膜組織炎癥反應(yīng)。

研究表明，NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，其信號(hào)通路參與許多生理過程，包括炎癥反應(yīng)和先天免疫的調(diào)節(jié)[14-17]。NF-κB信號(hào)通路的異常激活促進(jìn)炎癥因子，如Notch1、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和TNF-α的表達(dá)，誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和大量中性粒細(xì)胞聚集，可引發(fā)一系列病理損傷變化，例如腸上皮細(xì)胞損傷和小血管炎，這導(dǎo)致黏膜免疫細(xì)胞和趨化因子增加，繼而引起腸通透性增加[18-20]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1 mRNA蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，經(jīng)和調(diào)健脾方治療后，和調(diào)健脾方低、高劑量組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、Notch1 mRNA蛋白表達(dá)水平降低，且呈劑量依賴性；說明和調(diào)健脾方可能通過抑制NF-κB、Notch1 mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制NF-κB/Notch通路的激活，從而改善腹瀉型腸易激綜合征大鼠腹瀉癥狀，減輕大鼠血清和結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)。另外，腹瀉型腸易激綜合征大鼠的黏膜炎癥增加，引起腸黏膜破壞，腸黏膜屏障功能受損，腸通透性增加，用和調(diào)健脾方治療可以抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)腸道通透性。

綜上所述，和調(diào)健脾方可改善腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠腹瀉癥狀，減輕大鼠血清和結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)；其機(jī)制可能與和調(diào)健脾方抑制NF-κB、Notch1 mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)而抑制NF-κB/Notch1通路的激活有關(guān)。