占繡萍，黃蘭淇，陳建波，馬 琳，趙 莉，陳 秀

(上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，上海 201103)

殺菌劑百菌清(Chlorothalonil，CTN)是一種高效、低毒的非內(nèi)吸性廣譜有機(jī)氯殺菌劑，子囊菌綱，擔(dān)子菌綱，半知菌綱和卵菌綱等真菌都有效，因此被廣泛應(yīng)用于蔬菜、瓜果、經(jīng)濟(jì)作物和豆類(lèi)、水稻、小麥等作物及森林等多種作物病害的防治[1]。 殺蟲(chóng)劑毒死蜱(Chlorpyrifos)又名氯吡硫磷、樂(lè)斯本，屬乙酰膽堿酯酶抑制劑，是世界上應(yīng)用最廣泛的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑之一，具有高效、低中毒，胃毒和熏蒸等特性，作為農(nóng)用殺蟲(chóng)劑可在多種作物上防治百余種害蟲(chóng)[2]，而近些年發(fā)現(xiàn)由于毒死蜱的大面積使用，在水果、蔬菜上殘留超標(biāo)事件時(shí)有發(fā)生，而且毒死蜱對(duì)水生生物有較高毒性。殺蟲(chóng)劑蟲(chóng)螨腈(Chlorfenapyr)又名溴蟲(chóng)腈，該藥是芳基取代吡咯類(lèi)化合物，作用于昆蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞的線粒體上，通過(guò)昆蟲(chóng)體內(nèi)的多功能氧化酶起作用，該藥具有胃毒及觸殺作用于害蟲(chóng)，在植物頁(yè)面滲透性強(qiáng)，有一定的內(nèi)吸作用，可以控制對(duì)氨基甲酸酯類(lèi)、有機(jī)磷和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的昆蟲(chóng)和某些螨類(lèi)。其啥蟲(chóng)譜廣，對(duì)常規(guī)農(nóng)藥無(wú)交互抗性[3]。

我國(guó)對(duì)百菌清、毒死蜱、蟲(chóng)螨腈的殘留分析，已經(jīng)有氣相色譜法、液相色譜法、以及氣相色譜-負(fù)化學(xué)電離質(zhì)譜法(GC-NCIMS)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等，但是針對(duì)綠葉菜上同時(shí)檢測(cè)這3種農(nóng)藥的方法還未見(jiàn)報(bào)道。本研究是根據(jù)前期市場(chǎng)葉類(lèi)蔬菜抽檢超標(biāo)、檢出率高的農(nóng)藥品種情況并結(jié)合項(xiàng)目要求，開(kāi)展了利用氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)法，針對(duì)不同凈化劑參考QuEChERS方法進(jìn)行探索性改進(jìn)。葉類(lèi)蔬菜相比其他蔬菜色素深、基質(zhì)復(fù)雜等，因此檢測(cè)中需要篩選檢測(cè)條件，改進(jìn)前處理方法，才能更好的完成準(zhǔn)確、快速地農(nóng)殘檢測(cè)。本研究就凈化方法中吸附劑的選擇、用量比例和儀器色譜條件等進(jìn)行了比較和研究，建立了快速測(cè)定青菜、杭白菜、生菜、菠菜等4種葉菜中百菌清、毒死蜱、蟲(chóng)螨腈等農(nóng)藥多殘留方法，相對(duì)傳統(tǒng)的固相萃取方法，更為省時(shí)、省力、省溶劑。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑和材料 儀器：Agilent7890氣相色譜儀，高速勻漿分散器，電熱恒溫水浴鍋，氮吹濃縮器，恒溫振蕩器，離心機(jī)。標(biāo)準(zhǔn)品：百菌清、毒死蜱、蟲(chóng)螨腈 濃度1 000mg/L。

氣相色譜柱：HP-1毛細(xì)管色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)；HP-5毛細(xì)管色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)。試劑∶氯化鈉為分析純，丙酮、乙腈為色譜純。十八烷基鍵和硅膠(C18)吸附劑：43-60μm，N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑：43-60μm，交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮(PVP-P)吸附劑：USP級(jí)，粉末；無(wú)水硫酸鎂。

1.2 樣品制備與保存 青菜、生菜、杭白菜、菠菜：樣品送回實(shí)驗(yàn)室后，將樣品混勻，采用四分法縮分樣品，取出其中的1/4在制樣機(jī)中打碎，裝到帶蓋的塑料瓶中，貯存在-20℃的冰柜中冷凍保存。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取 青菜、生菜、杭白菜、菠菜樣品：稱(chēng)取5g樣品加入到100mL聚四氟乙烯管中，加20mL乙腈溶液高速勻漿1min，加入1～2g無(wú)水氯化鈉，蓋上蓋子，渦旋1min，再以4 000r/min高速離心5min，待乙腈相和水相分層。

1.3.2 凈化 青菜、生菜、杭白菜、菠菜樣品：取5mL上層乙腈相溶液置于裝有100mg C18、100mg PSA、300mg MgSO4、50mg PVPP的離心管中，渦旋30s， 以4 000r/min離心3min，吸取上清液2mL置燒杯中，50℃水浴鍋中氮吹至近干，1mL丙酮定容，過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.4 檢測(cè)條件 色譜柱∶30m×0.32mm，0.25μm，內(nèi)填HP-1毛細(xì)管色譜柱，進(jìn)樣口溫度：260℃；柱溫：初始溫度100℃，保持1min，以25℃/ min的速率升溫至250℃，保持3min，35℃/min的速率升溫至280℃，保持3min。檢測(cè)器溫度：280℃；柱流量：1.8mL/min；進(jìn)樣量1μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化劑的選擇 QuEChERS方法[4-8]作為一種目前新型的前處理方法，較普通的SPE方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)；QuEChERS方法只需要很少的凈化填料，無(wú)需淋洗等步驟，操作簡(jiǎn)單，所需時(shí)間少；由于所需試劑價(jià)格相對(duì)低廉，且無(wú)需購(gòu)買(mǎi)SPE小柱，所以本研究參考QuEChERS方法進(jìn)行凈化劑材料的篩選組合優(yōu)化。如N-丙基乙二胺(PSA)、C18、石墨化炭黑(GCB)是常用的吸附劑材料。PSA吸附劑可有效去除樣品中的有機(jī)酸、脂肪酸和糖等干擾物；C18吸附劑對(duì)極性較弱的脂肪酸、烯烴類(lèi)及甾醇類(lèi)、色素等大分子基質(zhì)干擾物有較好的吸附效果；GCB吸附劑對(duì)去除葉綠素類(lèi)、胡蘿卜素等色素以及固醇類(lèi)雜質(zhì)有很好的效果。另外探索性的嘗試了文獻(xiàn)中常用來(lái)去除茶葉茶多酚的交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮(PVP-P)吸附劑進(jìn)行組合比較。

試驗(yàn)選擇青菜樣品進(jìn)行研究，采用C18、PSA、MgSO4、PVP-P、GCB 5種凈化劑不同組合進(jìn)行比較，凈化效果圖和所得的回收率結(jié)果(表1)和(圖1)。從表中可以發(fā)現(xiàn)，方法2和方法3中GCB對(duì)百菌清有很強(qiáng)的吸附性，回收率很低，毒死蜱和蟲(chóng)螨腈這兩種農(nóng)藥不會(huì)被GCB吸附，回收率滿足要求；方法1、方法4和方法5， 3種農(nóng)藥的添加回收率均滿足要求。但從去除綠色素和色譜圖的雜質(zhì)峰等角度來(lái)看，方法4、5的組合優(yōu)于方法1，方法4和方法5相差不大，因此本研究綜合最佳的凈化劑組合方法，首選方法4(100mgC18+100mgPSA+300mg MgSO4+50mg PVPP)為本研究的凈化劑組合方法。

表1 添加0.1mg/L的方法回收率

圖1 5種方法凈化回收率比較

2.2 色譜柱的選擇 比較了本實(shí)驗(yàn)室常用的Agilent色譜柱：100%聚甲基硅氧烷HP-1(30m×0.32mm，0.25μm)和5%苯基聚硅氧烷HP-5(30m×0.32mm，0.25μm)，發(fā)現(xiàn)相同濃度的混標(biāo)上機(jī)檢測(cè)，百菌清和蟲(chóng)螨腈在HP-1柱上靈敏度更高，峰形更好，因此本實(shí)驗(yàn)建議首選HP-1(30m×0.32mm，0.25μm)色譜柱用研究，并且使用過(guò)程中要注意保護(hù)色譜柱(如注意柱溫的最高點(diǎn)使用以及樣品前處理的凈化)，以延長(zhǎng)色譜柱的壽命。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限和定量限 基質(zhì)指的是樣品中除分析物以外的組分，由于基質(zhì)常常對(duì)分析物的分析過(guò)程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾被稱(chēng)為基質(zhì)效應(yīng)。 由于蔬菜樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，干擾物較多，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)農(nóng)殘檢測(cè)結(jié)果影響較大[9-10]。樣品中干擾儀器分析的雜質(zhì)應(yīng)通過(guò)前處理過(guò)程盡可能去除，試驗(yàn)證明樣品純化仍是最佳的基質(zhì)效應(yīng)消除方法。本研究采用相對(duì)響應(yīng)值法，基質(zhì)效應(yīng)=空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值×100%，基質(zhì)效應(yīng)>100時(shí)，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；基質(zhì)效應(yīng)<100時(shí)，為基質(zhì)抑制效應(yīng)。研究表明3種農(nóng)藥在青菜的基質(zhì)效應(yīng)：部分基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)值最高的達(dá)到137%，基質(zhì)效應(yīng)減弱最低值為85.6%，因此這3種農(nóng)藥在葉類(lèi)蔬菜中基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)和減弱效應(yīng)都存在。

表2 3種農(nóng)藥的保留時(shí)間、基質(zhì)效應(yīng)、在基質(zhì)中的線性關(guān)系、檢出限和定量限

續(xù)表

2.4 添加回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 選用不含目標(biāo)化合物的青菜、菠菜、生菜、杭白菜等4種空白樣品，通過(guò)添加回收試驗(yàn)，考察了方法的回收率和精密度(n=5)。毒死蜱、蟲(chóng)螨腈農(nóng)藥的添加濃度水平為0.05、0.2、1.0mg/kg(百菌清的添加水平為0.25、1.0、5.0mg/kg)，結(jié)果表明，3種農(nóng)藥的純標(biāo)計(jì)算的平均添加回收率為69.7%～194.4%，RSD在3.0%～29.5%之間；基標(biāo)計(jì)算的平均添加回收率為63.5%～138.8%(因百菌清在氣相上出峰不夠穩(wěn)定，導(dǎo)致回收率偏高或者偏低)，RSD在0.7%～19.3 %之間，總體而言，基標(biāo)峰面積更穩(wěn)定，因此選用基標(biāo)計(jì)算的回收率和精密度更能滿足殘留分析要求。

表3 3種農(nóng)藥的純標(biāo)計(jì)算的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

表4 3種農(nóng)藥的基標(biāo)計(jì)算的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

續(xù)表

2.5 色譜出峰條件 百菌清、毒死蜱、蟲(chóng)螨腈標(biāo)樣保留時(shí)間分別為7.23、8.23、9.76min。0.1mg/L標(biāo)樣、青菜、生菜、杭白菜、菠菜空白樣品樣品色譜圖(圖2～6)。

圖2 0.1mg/L標(biāo)樣色譜圖

圖3 青菜空白樣品色譜圖

圖4 生菜空白樣品色譜圖

圖5 杭白菜空白樣品色譜圖

圖6 菠菜空白樣品色譜圖

3 小結(jié)

本文建立了對(duì)青菜、菠菜、生菜、杭白菜等葉類(lèi)蔬菜中百菌清、毒死蜱、蟲(chóng)螨腈等3種高風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測(cè)的QuEChERS-GC/ECD方法。該方法從保護(hù)毛細(xì)管色譜柱、前處理方法經(jīng)濟(jì)環(huán)保的角度考慮，針對(duì)高色素、基質(zhì)復(fù)雜的樣品前處理進(jìn)行了篩選優(yōu)化，總體看來(lái)方法簡(jiǎn)便快捷、靈敏可靠，同時(shí)提高了實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)速度，為日常蔬菜監(jiān)測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥殘留、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等研究提供了一種高效、可靠的分析手段。