董 倩 ，趙熾娜 ，李俊凱 ，b

（長江大學(xué)，a.農(nóng)學(xué)院；b.農(nóng)藥研究所，湖北 荊州 434025）

殺菌劑在植物病害防治過程中發(fā)揮了重要作用，特別是內(nèi)吸性殺菌劑的出現(xiàn)對植物維管束病害和根部病害的防治發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。內(nèi)吸性殺菌劑的使用可以減少農(nóng)藥殘留量，減少環(huán)境污染，并在一定程度上增強(qiáng)藥效［1，2］。但目前國內(nèi)外研制的大多數(shù)內(nèi)吸性殺菌劑只能在植物質(zhì)外體移動，如苯并咪唑類、哌嗪類等殺菌劑都只能通過根部吸收在植物體內(nèi)從下往上運(yùn)輸，而無法通過葉面噴施來防治根部和維管束病害［3］。如果殺菌劑能通過莖葉噴霧后，經(jīng)植物韌皮部向下傳導(dǎo)來防治維管束病害和根部病害，不僅能有效防治此類病害，而且可以大大減少農(nóng)藥用量，降低勞動成本，減輕環(huán)境污染，但截至目前能通過韌皮部向下傳導(dǎo)的殺菌劑數(shù)量相當(dāng)有限。因此，研究和開發(fā)能通過植物韌皮部傳導(dǎo)的新型內(nèi)吸性殺菌劑對提高農(nóng)藥使用效率具有重要意義。

為了改善殺菌劑在植物韌皮部的傳導(dǎo)性，李俊凱等［4］將在植物體內(nèi)具有向基性傳導(dǎo)的吲哚乙酸與不能向基性傳導(dǎo)的化學(xué)殺菌劑三唑醇化合后施用于大豆植株的葉片，發(fā)現(xiàn)該化合物能向基傳導(dǎo)至植株的根部。和拌種靈相比，拌種靈-丙氨酸耦合物能更迅速進(jìn)入懸浮培養(yǎng)的大豆細(xì)胞，說明丙氨酸官能團(tuán)可能會引導(dǎo)該衍生物通過主動吸收的方式進(jìn)入植物細(xì)胞［5］。另外，以韌皮部傳導(dǎo)的水楊酸與殺菌劑拼接后還具有增效的作用［6］。2019 年，Xiong 等［7］在申嗪霉素-氨基酸耦合物的氨基酸氮原子上引入不同取代基，發(fā)現(xiàn)所得到的化合物一定程度上保留了其傳導(dǎo)性；另一方面，保留申嗪霉素分子結(jié)構(gòu)中的羧基，而在申嗪霉素吩嗪環(huán)的7 號位引入氨基酸官能團(tuán)，顯著增加了這些化合物在韌皮部的傳導(dǎo)性，暗示了氨基酸與申嗪霉素耦合物的傳導(dǎo)性與耦合位點具有十分重要的關(guān)系［7］。這些研究都說明了氨基酸引入到殺菌劑分子中后能一定程度上介導(dǎo)殺菌劑在植物韌皮部的傳導(dǎo)。申嗪霉素作為一種新型微生物源殺菌劑，主要用于防治水稻紋枯病、西瓜枯萎病、小麥赤霉病和辣椒疫病等多種植物病害，具有高效、低毒及環(huán)境相容性好的特點，但是不具備韌皮部輸導(dǎo)性，導(dǎo)致其使用方法和應(yīng)用范圍有一定局限性［8-10］。在前期研究中，筆者所在研究團(tuán)隊為了改善其韌皮部輸導(dǎo)性，將其與氨基酸進(jìn)行耦合，得到了一系列的申嗪霉素-氨基酸耦合物，利用蓖麻幼苗模式植物進(jìn)行室內(nèi)傳導(dǎo)試驗，發(fā)現(xiàn)申嗪霉素-L-纈氨酸在眾多氨基酸耦合物中具有較優(yōu)的韌皮部輸導(dǎo)性，且具有一定的殺菌活性［11］。但這種化合物在成熟作物上的傳導(dǎo)性和系統(tǒng)分布尚需進(jìn)一步深入研究。本研究以申嗪霉素-纈氨酸耦合物為供試藥劑，以單子葉作物小麥（Triticum aestivumL.）為供試作物，深入研究其是否有由主莖向分蘗間傳導(dǎo)的特性及其在整株間的分布特性，以期為進(jìn)一步探索氨基酸介導(dǎo)下農(nóng)藥在作物中內(nèi)吸傳導(dǎo)及韌皮部傳導(dǎo)的新型殺菌劑的研究與開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 供試小麥為鄭麥9023（生長期：分蘗期），由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所提供。供試藥劑有申嗪霉素原藥（PCA，含量99.9%），由上海交通大學(xué)提供；申嗪霉素-L-纈氨酸耦合物（PCA-LVal）和申嗪霉素-D-纈氨酸耦合物（PCA-D-Val），由長江大學(xué)農(nóng)藥研究所合成并提供。

供試儀器主要有Thermo UltiMate3000 TSQGuantis 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS型），美國賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scien?tific）；雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901 型），北京普析通用儀器有限公司。

1.1.2 藥液配制 準(zhǔn)確稱取一定量的PCA、PCA-LVal 和 PCA-D-Val 于 10 mL 容量瓶中，加入 1 mL 二甲基亞砜（DMSO）超聲溶解，添加2 滴滲透劑T、3 滴丙三醇和0.1% 的吐溫80 于容量瓶內(nèi)，混合均勻后用去離子水稀釋至一定體積，使得最終藥劑濃度為200 μmol/L，待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試植物藥劑處理方法 每盆塑料盆缽裝有基質(zhì)及沙土（體積比3∶1），小麥催芽后，種植在塑料盆缽中，平均每盆播種20 顆，播種后澆水使土壤徹底濕潤。將塑料盆缽置于溫室環(huán)境下培養(yǎng)，待小麥長至分蘗期時，用柔軟的毛筆在小麥主莖的所有葉片上分別均勻涂布200 μmol/L 的3 種供試藥劑，并設(shè)置清水對照，各處理重復(fù)3 次。

1.2.2 采樣處理 小麥分蘗期的取樣部位為主莖葉片、分蘗葉片、根部，取樣時間為處理后3、9、18、30、48 h。

1.2.3 小麥植株樣品的前處理方法 準(zhǔn)確稱取小麥葉片樣品3.00 g，置于150 mL 磨口三角瓶中，加入50 mL 甲醇，于研缽中充分研磨，超聲提取30 min，抽濾，用甲醇分別超聲提取2 次，合并濾液；濾液過無水硫酸鈉漏斗除水后，旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，待凈化。將濃縮提取液用少許二氯甲烷轉(zhuǎn)移至250 mL 分液漏斗中，加入50 mL 10%的氯化鈉水溶液和5 mL 1 mol/L 氫氧化鈉溶液，混勻后用二氯甲烷分2 次振蕩萃取；棄去二氯甲烷相，堿性水相用冰乙酸調(diào)節(jié)pH 至弱酸性，再用二氯甲烷振蕩萃取3 次，靜置至完全分層，收集二氯甲烷相，合并濾液，經(jīng)無水硫酸鈉除水后，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用色譜甲醇溶解，使用氮吹儀定容至1.00 mL，過0.22 μm 濾膜，待測。

1.2.4 液相色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為Hypersil-Gold-C18（100 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）。梯度洗脫程序為0~2.0 min，95%A；2.0~6.0 min，95%~2%A；6.0~8.0 min，2% A；8.1~10.0 min，2%~95% A；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正離子掃描；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測。電噴霧電壓為3 500 V；離子化溫度為350 ℃；毛細(xì)管溫度為400 ℃，霧化氣和氣簾氣均為高純氮氣；碰撞氣為氬氣，碰撞氣壓力為0.2 Pa；鞘氣流速為30 L/min；輔助氣流速為5.0 L/min；PCA定量離子對225.1/207.0，碰撞能量26 V；定性離子對225.1/152.0，碰撞能量45 V。PCA-L-Val和PCA-D-Val選擇m/z324.1/207.0 作為定量離子對、m/z324.1/278.1作為定性離子對，碰撞能量45 V。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取 PCA 純品 0.004 5 g、PCA-L-Val 和 PCA-D-Val 純品0.006 5 g，移至容量瓶中，用甲醇溶解定容至100 mL，搖勻，配制成200 μmol/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液用色譜甲醇稀釋配制0.031、0.310、1.500、3.000、6.000、15.000、25.000 μmol/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的LC-MS/MS 檢測條件下測定。提取供試化合物的定量離子，以該定量離子的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，相應(yīng)PCA、PCA-L-Val 和 PCA-D-Val 的濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式及相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及添加回收率

申嗪霉素及其纈氨酸耦合物質(zhì)譜與色譜結(jié)果分別如圖1、圖2、圖3 所示，添加回收率結(jié)果如表1 所示。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液中供試藥劑在選定的濃度范圍內(nèi)與檢測峰面積呈線性關(guān)系，得到PCA 標(biāo)準(zhǔn)溶液的回歸線性方程式為y=2×106x-1 501.5，相關(guān)系數(shù)為0.999 9；PCA-L-Val 標(biāo)準(zhǔn)溶液的回歸線性方程式為y=1×106x-34 786，相關(guān)系數(shù)為0.999 6；PCAD-Val 標(biāo)準(zhǔn)溶液的回歸線性方程式為y=2×106x-21 363，相關(guān)系數(shù)為0.999 7。以上結(jié)果表明，申嗪霉素-纈氨酸耦合物標(biāo)準(zhǔn)溶液與其相對應(yīng)的色譜峰面積選定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，符合農(nóng)藥殘留定量分析的標(biāo)準(zhǔn)。

表1 供試化合物在小麥葉、莖、根部基質(zhì)中的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

在0.150、1.500、3.000 μmol/L 3 個添加水平下進(jìn)行添加回收試驗，結(jié)果（表1）表明，PCA 的平均回收率范圍為83.24%~89.72%，RSD（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）范圍為1.81%~4.97%；PCA-L-Val 的平均回收率范圍為 89.92%~94.21%，RSD范 圍 為 2.11%~11.51%；PCA-D-Val 的平均回收率范圍為89.25%~93.63%，RSD范圍為1.21%~5.18%。這表明該檢測方法可行，符合農(nóng)藥殘留分析的要求。

2.2 供試化合物在分蘗期小麥植株中各部位的含量分布

使用濃度為200 μmol/L 的藥液葉面處理小麥主莖葉片后，采用LC-MS/MS 檢測小麥植株鮮樣中各部位供試化合物的含量，結(jié)果如表2 所示。結(jié)果表明，使用申嗪霉素-纈氨酸耦合物處理小麥主莖葉片后，在植株根部可檢測到相應(yīng)化合物存在，而申嗪霉素處理小麥主莖葉片后在植株根部未檢測到其存在，說明申嗪霉素-纈氨酸耦合物具有在小麥植株韌皮部傳導(dǎo)的特性；其中，藥劑處理后3~48 h，PCAL-Val 在小麥根部中的含量隨著時間推移呈先增加后減少的趨勢，且在18 h 達(dá)到最大值，為15.50 μmol/kg，PCA-D-Val 也表現(xiàn)出同樣的變化趨勢，且在同一時刻達(dá)到最大值，為11.37 μmol/kg；總體而言，PCA-L-Val 在分蘗期小麥植株中的韌皮部傳導(dǎo)性強(qiáng)于PCA-D-Val。同時在小麥的分蘗葉片中也檢測到供試化合物的含量，但是經(jīng)申嗪霉素處理小麥后在該植株分蘗葉片中未檢測到其含量，說明申嗪霉素-纈氨酸耦合物還具備了由主莖向分蘗間傳導(dǎo)的特性；其中，PCA-L-Val 葉面處理小麥3 h 后該化合物在分蘗中的含量達(dá)到最大值，為8.74 μmol/kg，而PCA-D-Val 在同一時刻也達(dá)到最大值，為4.54 μmol/kg，且二者隨著時間推移在小麥分蘗中的含量總體呈下降趨勢。以上結(jié)果表明，PCA-L-Val 在小麥上的這種傳導(dǎo)特性強(qiáng)于PCA-D-Val。

表2 不同時間下供試化合物處理分蘗期小麥后植株鮮樣中各部位含量

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，申嗪霉素-纈氨酸耦合物具有在小麥韌皮部傳導(dǎo)的特性，分蘗期小麥植株根部檢測到目標(biāo)化合物含量最高可達(dá)15.50 μmol/kg，并且處理時間為3 h 時根部申嗪霉素-L-纈氨酸的檢測量與處理時間為48 h 時的檢測量接近，說明其能在根部穩(wěn)定積累。更重要的是，還發(fā)現(xiàn)該耦合物在小麥分蘗期有從主莖向分蘗間傳導(dǎo)的特性，小麥植株分蘗中的纈氨酸耦合物含量最高可達(dá)8.74 μmol/kg。由此可知，與不具備韌皮部傳導(dǎo)性的申嗪霉素相比，纈氨酸的引入賦予了耦合物在小麥植株體內(nèi)向下的傳導(dǎo)性，而且還具有從主莖向分蘗傳導(dǎo)的特性，此結(jié)果對開發(fā)具有植物韌皮部傳導(dǎo)能力的新型殺菌劑意義重大。

對比同一處理濃度下2 種構(gòu)型的申嗪霉素-纈氨酸耦合物在小麥體內(nèi)的含量分布情況，申嗪霉素-L-纈氨酸耦合物在分蘗上和根部的含量都明顯高于申嗪霉素-D-纈氨酸耦合物。D構(gòu)型的纈氨酸耦合物在根部能檢測到的最大含量為11.37 μmol/kg，而L 構(gòu)型的纈氨酸耦合物在根部能檢測到的最大含量為15.50 μmol/kg，說明L 構(gòu)型纈氨酸的引入更有利于耦合物在小麥上內(nèi)吸傳導(dǎo)性的提高，這也與YU等［11］在蓖麻上的研究相符合。本研究再次證實了不同構(gòu)型的氨基酸引入對活性母體在作物中的內(nèi)吸傳導(dǎo)性具有不同的影響。

在此前的研究中利用申嗪霉素-L-丙氨酸酯及其水解產(chǎn)物申嗪霉素-L-丙氨酸進(jìn)行了蓖麻傳導(dǎo)性試驗，結(jié)果表明，申嗪霉素-L-丙氨酸酯不具備韌皮部傳導(dǎo)性，其水解產(chǎn)物申嗪霉素-L-丙氨酸卻具有韌皮部傳導(dǎo)性［12］。進(jìn)一步分析認(rèn)為，申嗪霉素-氨基酸酯類耦合物之所以不能傳導(dǎo)，可能是因為氨基酸酯耦合物并不能被氨基酸運(yùn)輸載體所識別，將氨基酸羧基脫保護(hù)后則能夠被相應(yīng)的載體識別、運(yùn)輸并表現(xiàn)出在植物韌皮部優(yōu)良的傳導(dǎo)性［3］。關(guān)于氨基酸與農(nóng)藥耦合后形成的化合物在植物韌皮部中的傳導(dǎo)是否利用了氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究目前也有了一定的基礎(chǔ)。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物具有多樣性，它們作用下的藥物吸收在韌皮部的轉(zhuǎn)運(yùn)是一個精細(xì)的過程，涉及錯綜復(fù)雜的機(jī)制。其中，AAPs 家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對酸性和中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力一般［13］，但是AtA?AP6 蛋白則對中性氨基酸和谷氨酰胺具有較高的親和力［14］；Ren 等［15］的研究表明，過表達(dá)擬南芥中的AtAAP1基因增加了根和原生質(zhì)體對氯蟲苯甲酰胺-丙氨酸耦合物的吸收。Jiang 等［16］的研究表明，氟蟲腈-L-谷氨酰胺的攝取與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體AtLHT1的表達(dá)之間存在直接的相關(guān)性。Chen 等［17］的研究表明，缺乏AtLHT1基因的幼苗無論是對氯蟲苯甲酰胺-甘氨酸耦合物的吸收還是從根到莖的轉(zhuǎn)運(yùn)都表現(xiàn)出減少的趨勢。由于除了沒有立體構(gòu)型的甘氨酸外，高等植物中幾乎所有的氨基酸都是L 型［18］。所以提出了以下推測：申嗪霉素-L 纈氨酸耦合物在小麥體內(nèi)更容易被其相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所識別，另一方面，L 構(gòu)型的纈氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同樣可以識別D 構(gòu)型的纈氨酸，但識別能力較低。因此，可以解釋在小麥體內(nèi)檢測到申嗪霉素-L-纈氨酸耦合物的含量比申嗪霉素-D-纈氨酸耦合物的含量高。但是究竟申嗪霉素-纈氨酸耦合物的傳導(dǎo)性是否利用了小麥體內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)行傳導(dǎo)，作為導(dǎo)向化合物的氨基酸種類和結(jié)構(gòu)與耦合物的傳導(dǎo)性之間存在何種關(guān)系，作為導(dǎo)向化合物的氨基酸種類與載體的類型之間存在何種關(guān)系，這些關(guān)鍵問題仍需要進(jìn)一步解決。