宋立梅,肖志新,謝俊霞,徐華敏

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是中老年人神經(jīng)退行性疾病中僅次于阿爾茲海默病的第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其主要的臨床表現(xiàn)為運動障礙，主要的病理變化為黑質(zhì)(SN)多巴胺能神經(jīng)元受損，但其病因和發(fā)病機制目前尚未完全闡明。眾多研究結(jié)果已證實，鐵代謝障礙參與了PD的發(fā)病[1-3]。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)是由1-甲基-4-苯基-4-丙氧基哌啶(MPPP)合成的副產(chǎn)物[4]。MPTP本身不具有毒性，但進(jìn)入大腦后在單胺氧化酶B(MAO-B)的作用下轉(zhuǎn)化成具有毒性的甲基-苯基-吡啶離子(MPP+)，被多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)特異性轉(zhuǎn)運到SN多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)誘導(dǎo)PD的發(fā)生[5-8]。有研究表明，MPTP能夠誘導(dǎo)小鼠SN鐵的沉積[9]。最新研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)鐵運輸具有兩條途徑，其中一條途徑為腹側(cè)海馬(vHip)到內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(mPFC)再到SN[10]。但是，此途徑異常是否是導(dǎo)致PD模型SN區(qū)鐵沉積的重要原因，目前尚未有報道。本研究采用MPTP誘導(dǎo)PD小鼠模型，檢測其SN區(qū)及mPFC區(qū)鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級8周齡雄性C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物公司。飼養(yǎng)條件：溫度(21±2)℃，濕度(50±5)%，12-12 h循環(huán)晝夜光照，自由飲水進(jìn)食。實驗前適應(yīng)實驗室環(huán)境1周。

1.1.2實驗藥品 MPTP(Sigma-Aldrich)，用生理鹽水稀釋成6 g/L，注射量為30 mg/kg。

1.2 實驗方法

1.2.1動物分組及處理 將12只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為對照組和MPTP組，每組6只小鼠。MPTP組小鼠連續(xù)5 d給予MPTP 30 mg/kg腹腔注射構(gòu)建亞急性PD動物模型，對照組小鼠給予等量生理鹽水腹腔注射。

1.2.2爬桿實驗 自制直徑1.2 cm、高50 cm的直木桿，桿頂部有一小木球，用紗布包裹防止小鼠打滑。實驗前1 d訓(xùn)練小鼠，實驗時在安靜的實驗環(huán)境下將小鼠頭向上放于爬桿頂端，用秒表記錄小鼠開始運動至完全轉(zhuǎn)為頭向下的時間(轉(zhuǎn)頭時間)和小鼠爬下桿至四肢落地的時間(下桿時間)。每次檢測間隔1 min，共檢測5次，取平均值。

1.2.3Western Blot檢測SN和mPFC區(qū)鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)變化 行為學(xué)檢測結(jié)束后，給予小鼠聯(lián)合麻藥(水合氯醛+烏拉坦)40 g/L腹腔注射麻醉，在冰上迅速解剖SN和mPFC區(qū)，將剖出組織按每4 mg加入100 μL裂解液充分研磨后冰上裂解30 min，4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，提取上清。用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。按1∶4加入Loading buffer，金屬浴100 ℃煮5 min。蛋白經(jīng) SDS-PAGE 電泳(電壓80～120 V)后濕轉(zhuǎn)至 PVDF膜上，用含有50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，再分別加入二價金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白1(DMT1，1∶800)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TfR1，1∶1 000)、鐵蛋白重鏈(H-Ferritin，1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)一抗，4 ℃搖床過夜。加HRP偶聯(lián)的二抗(用TBST稀釋至1∶10 000)，室溫孵育1 h。用UVP BioDoc-It成像系統(tǒng)(美國Upland)和ECL高靈敏化學(xué)發(fā)光液試劑盒(Milipore)顯影，采用Image J分析軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 MPTP對小鼠運動功能的影響

爬桿實驗結(jié)果顯示，對照組和MPTP組小鼠轉(zhuǎn)頭時間分別為(1.925±0.182)和(3.242±0.513)s，下桿時間則分別為(6.001±0.396)和(9.872±1.045)s，MPTP組小鼠轉(zhuǎn)頭時間和下桿時間與對照組相比較均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.420、3.464，P<0.05)。

2.2 MPTP對小鼠SN區(qū)鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

本文實驗結(jié)果表明，與對照組相比較，MPTP組小鼠SN區(qū)H-Ferritin、DMT1蛋白的表達(dá)明顯增加(t=3.969、3.333，P<0.01)，TfR1蛋白的表達(dá)明顯下降(t=2.318，P<0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠SN區(qū)鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

2.3 MPTP對小鼠mPFC區(qū)鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

兩組小鼠mPFC區(qū)DMT1、TfR1和H-Ferritin蛋白表達(dá)比較，差異均無顯著性(t=0.096～0.4279，P>0.05)。見表2。

表2 兩組小鼠mPFC區(qū)鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

3 討 論

PD是中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其臨床特征為靜止性震顫、肌強直、運動減少等運動障礙。目前PD的病因和發(fā)病機制尚不明確，可能與環(huán)境因素、遺傳因素、氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)等有關(guān)。有研究表明，SN區(qū)的鐵沉積參與了PD的發(fā)病[11-12]。在MPTP和6-羥基多巴胺(6-OHDA)構(gòu)建的PD小鼠模型中均出現(xiàn)了明顯的鐵沉積及鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)異常[13-18]。

鐵代謝對于正常腦功能的發(fā)育至關(guān)重要。鐵攝取主要通過轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)途徑和非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵(NTBI)轉(zhuǎn)運途徑。Tf-TfR途徑被認(rèn)為是大腦攝取鐵的主要途徑，而TfR1是該途徑的主要受體。NTBI途徑主要通過DMT1來攝取二價鐵離子。鐵的儲存主要由鐵蛋白來完成，鐵蛋白由H-Ferritin和輕鏈鐵蛋白(L-Ferritin)組成，H-Ferritin具有亞鐵氧化酶的活性，能將二價鐵離子轉(zhuǎn)為三價鐵離子；L-Ferritin存在成核位點，能促進(jìn)鐵核的形成。在腦鐵代謝過程中任何環(huán)節(jié)異常均可能引起鐵代謝障礙，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。有病例對照研究結(jié)果表明，Tf-TfR可能參與了PD的發(fā)病，其機制可能與多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)的鐵代謝失調(diào)或線粒體功能障礙有關(guān)[19-21]。本實驗室研究證實，DMT1表達(dá)增加和鐵轉(zhuǎn)運蛋白(Fpn)表達(dá)下降可能是導(dǎo)致SN區(qū)鐵沉積的重要原因[14,22-23]。在PD病人和PD模型SN區(qū)均發(fā)現(xiàn)，鐵轉(zhuǎn)入蛋白DMT1的表達(dá)明顯升高[22-27]。有研究結(jié)果表明，PD動物模型SN區(qū)的鐵轉(zhuǎn)出蛋白Fpn表達(dá)下降[14,23,28-29]，但這一結(jié)果在PD病人中并未得到證實。

最新的研究證實了腦內(nèi)存在兩條鐵轉(zhuǎn)運途徑：一條是從vHip到mPFC再到SN的鐵轉(zhuǎn)運途徑；另一條則是從丘腦(Tha)到杏仁核(AMG)再到mPFC的鐵轉(zhuǎn)運途徑[10]。并且證實vHip到mPFC再到SN的鐵轉(zhuǎn)運途徑異常是焦慮發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]。PD病人的臨床表現(xiàn)中，除運動功能障礙外，還存在非運動癥狀的發(fā)生如焦慮、抑郁及記憶力障礙等[30]。mPFC區(qū)主要負(fù)責(zé)情緒調(diào)節(jié)，與焦慮、抑郁等有關(guān)，但是PD病人mPFC區(qū)鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)是否發(fā)生改變尚未有文獻(xiàn)報道。本實驗選用MPTP誘導(dǎo)的亞急性PD小鼠模型，進(jìn)行行為學(xué)和鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)檢測。行為學(xué)實驗結(jié)果顯示，MPTP組小鼠轉(zhuǎn)頭時間和下桿時間與對照組相比均明顯延長，提示PD小鼠模型構(gòu)建成功。Western Blot結(jié)果顯示，與對照組相比，MPTP組SN區(qū)鐵代謝相關(guān)蛋白H-Ferritin和DMT1表達(dá)水平明顯增加，TfR1蛋白表達(dá)水平明顯下降。提示DMT1的表達(dá)上調(diào)可能是SN鐵沉積的重要原因，而經(jīng)典鐵轉(zhuǎn)運途徑Tf-TfR途徑可能并不參與SN鐵沉積。此外，SN區(qū)H-Ferritin表達(dá)上調(diào)，可能與SN鐵水平增加有關(guān)。但mPFC區(qū)鐵代謝相關(guān)蛋白DMT1、TfR1、H-Ferritin的表達(dá)與對照組相比均無明顯變化。表明MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型鐵代謝蛋白的表達(dá)異常僅出現(xiàn)在SN，而mPFC區(qū)并無明顯的改變，提示mPFC區(qū)可能本身不具有儲存鐵的能力，與有關(guān)研究結(jié)果一致[10]。

綜上所述，MPTP能夠誘導(dǎo)小鼠運動障礙及SN區(qū)鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)改變，但并不會引起mPFC區(qū)鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)改變。腦鐵代謝的機制十分復(fù)雜且目前尚未完全闡明，仍需進(jìn)一步實驗研究。