石巍,王俊耐,張慧芳

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南 鄭州 450000)

卵巢癌作為一種常見女性惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，病死率高[1]。而卵巢癌以化療為主的治療手段因耐藥性其效果不容樂觀[2]。故有必要通過對(duì)卵巢癌發(fā)病機(jī)制的探究，尋找新型的腫瘤治療方法。ErbB2基因又稱HER2，隸屬于表皮生長因子受體家族[3]。ErbB2基因常高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中[4]，而且PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活性較高[5]，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性程度極高，提示腫瘤病人轉(zhuǎn)移率高、存活期縮短。而PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路是一種經(jīng)典的抗細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，該通路異常已被證實(shí)在眾多惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及放化療抵抗中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7]。PI3K抑制劑可有效抑制癌細(xì)胞增殖從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮腫瘤治療作用[8]。然而，目前關(guān)于ErbB2基因是否影響卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特性以及其與PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路相關(guān)的機(jī)制的研究未見報(bào)道。因此，本研究期望通過基因沉默技術(shù)，探究ErbB2基因沉默介導(dǎo)PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及可能機(jī)制，以期為卵巢癌分子靶向治療提供潛在證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人卵巢癌細(xì)胞株HO8910細(xì)胞(上海生物工程研究所提供)；RPMI-1640和DMEM(Gibco公司，美國)；RNA提取試劑盒(北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司)；紫外線分光光度儀(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)；ABI PRISM?7300系統(tǒng)(ABI，USA)；BCA試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；Wes-tern blot蛋白檢測的兔多克隆一抗和山羊抗兔IgG二抗(Abcam公司，Cambridge，MA，USA)；噻唑藍(lán)(MTT)溶液(Sigma公司，USA)；自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀(BIO-RAD公司，USA)；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(Sigma公司，USA)；Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)染色試劑盒(BestBio公司，上海)；流式細(xì)胞儀(BD公司，USA)；Matrigel基質(zhì)膠(BD公司，USA)；Transwell小室(康寧公司，USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及其分組處理 人卵巢癌細(xì)胞株HO8910細(xì)胞培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)0.1胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板80%～90%做傳代培養(yǎng)。棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。

本實(shí)驗(yàn)siRNA序列設(shè)計(jì)參照Genbank中報(bào)道的ErbB2的mRNA全序列，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司對(duì)所有片段進(jìn)行合成。選取對(duì)數(shù)生長期的HO8910細(xì)胞分為5組：空白對(duì)照組(A組：不轉(zhuǎn)染任何序列)、陰性對(duì)照組(B組：轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒)、siErbB2組(C組：轉(zhuǎn)染siRNA序列)、wortmannin組(D組：轉(zhuǎn)染PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路抑制劑wortmannin)、siErbB2+IGF-1組(E組：轉(zhuǎn)染siRNA序列+PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路激動(dòng)劑IGF-1)。

1.2.2實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測 采用RNA提取試劑盒抽提總RNA。采用紫外線分光光度法檢測組織和細(xì)胞中RNA的純度及濃度。設(shè)計(jì)ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bcl-2、Bax和GAPDH引物，交由TaKaRa公司合成。逆轉(zhuǎn)錄參照TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer說明書進(jìn)行。取反應(yīng)液進(jìn)行熒光定量PCR操作。在ABI PRISM?7300系統(tǒng)中進(jìn)行熒光定量PCR。以2-ΔCt表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍比關(guān)系。其計(jì)算公式如下：ΔCt=CtmiRNA-CtU6，分別計(jì)算細(xì)胞中ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA表達(dá)量。

1.2.3Western blot檢測 在細(xì)胞中加入蛋白裂解液，4 ℃裂解30 min；4 ℃下12 000 r/min離心20 min。取上清液采用BCA試劑盒測定每個(gè)樣品的蛋白濃度。本實(shí)驗(yàn)所用一抗為兔多克隆抗體ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG。孵育后，室溫下PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min。在暗室環(huán)境中用線片曝光，顯影、定影之后觀察結(jié)果。以GAPDH作內(nèi)參照，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶的灰度值之比作為蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4MTT法檢測 轉(zhuǎn)染24 h后，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度制備細(xì)胞懸液后，接種到96孔培養(yǎng)板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)取出培養(yǎng)板，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h終止培養(yǎng)，棄上清液，每孔加150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15 min，使紫結(jié)晶充分溶解。采用自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀于570 nm波長處測定各孔吸光度(A)值。最后根據(jù)所采集值，計(jì)算HO8910細(xì)胞的生長抑制率，繪制生長曲線。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞的密度。檢測前先離心10 min，棄上清后加入預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)0.70乙醇溶液固定細(xì)胞，4 ℃過夜。用100目的尼龍網(wǎng)過濾。離心棄上清，加入100 μL的RNA酶溶液。然后加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL 的PI輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300 μL結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀以激發(fā)波長488 nm檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn) 取Transwell小室及實(shí)驗(yàn)所需試劑溫育后，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度。首先于24孔板底部加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的培養(yǎng)基平衡，取配制細(xì)胞懸液加入Transwell小室，孵育過夜。培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，吸干上室固定液，行甲紫染色。輕擦去上室內(nèi)面未穿膜的細(xì)胞，光鏡下計(jì)算細(xì)胞穿膜數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)用Matrigel稀釋液模擬細(xì)胞外基質(zhì)，觀察細(xì)胞穿透向外浸潤的能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路因子mRNA和蛋白表達(dá)的變化

單因素方差分析顯示，5組間mRAN和蛋白表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.58～8.69，P均<0.05)。兩兩比較顯示，與空白對(duì)照組比較，siErbB2組和wortmannin組卵巢癌細(xì)胞中的Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著下降(P均<0.05)，Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著增加(P均<0.05)；siErbB2組ErbB2的mRNA和蛋白表達(dá)量則顯著下降(P均<0.05)；與siErbB2組相比較，siErbB2+IGF-1組細(xì)胞Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著上升，Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表達(dá)量則顯著下降(P均<0.05)。見圖1。

①各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測；②、③各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)的Western blot檢測。A：空白對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：siErbB2組；D：wortmannin組；E：siErbB2+IGF-1組。與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與siErbB2組相比，#P<0.05。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的增殖變化

MTT法檢測結(jié)果的單因素方差分析顯示，5組間的細(xì)胞增殖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.84，P<0.05)。兩兩比較的結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比較，siErbB2組和wortmannin組細(xì)胞增殖較慢(P均<0.05)；與siErbB2組比較，siErbB2+IGF-1組細(xì)胞增殖增加(P<0.05)。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)組別=7.31，P=0.002；F時(shí)間=10.49，P<0.001；F組別×?xí)r間=5.78，P<0.05。見圖2。

①細(xì)胞增殖率柱狀圖；②A值變化折線圖。A：空白對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：siErbB2組；D：wortmannin組；E：siErbB2+IGF-1組。與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與siErbB2組相比，#P<0.05。

2.3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞凋亡變化

單因素方差分析顯示，5組的凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.46，P<0.05)。兩兩比較顯示，與空白對(duì)照組相比較，siErbB2組和wortmannin組細(xì)胞凋亡率均明顯上升(P均<0.05)；對(duì)比siErbB2組，siErbB2+IGF-1組凋亡率明顯下降(P<0.05)。見圖3。

A：空白對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：siErbB2組；D：wortmannin組；E：siErbB2+IGF-1組。

2.4 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞遷移與侵襲的變化

轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的遷移結(jié)果單因素方差分析顯示，5組的遷移能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.57，P<0.05)。兩兩比較顯示，與陰性對(duì)照組相比較，siErbB2組和wortmannin組細(xì)胞遷移能力都顯著減弱(P均<0.05)；siErbB2+IGF-1組遷移能力明顯上升(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的侵襲結(jié)果單因素方差分析顯示，5組的侵襲能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.67，P<0.05)。兩兩比較顯示，與空白對(duì)照組相比，siErbB2組和wortmannin組細(xì)胞侵襲能力明顯降低(P均<0.05)；siErbB2+IGF-1組侵襲能力明顯上升(P<0.05)。見圖4。

①細(xì)胞遷移檢測；②細(xì)胞侵襲檢測。A：空白對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：siErbB2組；D：wortmannin組；E：siErbB2+IGF-1組。與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與siErbB2組相比，#P<0.05。

3 討 論

卵巢癌發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)癌癥第三，但其病死率卻位居之首[9-12]。其發(fā)病隱匿，化療等綜合治療效果不顯著[13-17]。因此，提高卵巢癌早期診斷水平并探究其分子機(jī)制，對(duì)于提高卵巢癌病人生存率至關(guān)重要。而RNA干擾自其發(fā)現(xiàn)以來，便成為基因研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[18-21]。基因沉默技術(shù)高效、方便，且具有極高特異性。ErbB2(HER2)基因在人類多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，且伴隨惡性程度更高的細(xì)胞表型，誘發(fā)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[22-25]。既往研究者推測ErbB2在腫瘤細(xì)胞中的過度表達(dá)，與相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常相關(guān)，可誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中良好的細(xì)胞生長環(huán)境[26]。也有學(xué)者報(bào)道，PI3K和Akt可以干擾細(xì)胞中ErbB2轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響該因子的致癌性[14]。因此，本研究作出如下假設(shè)：ErbB2基因沉默可能通過PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

本研究采用人卵巢癌細(xì)胞系HO8910細(xì)胞，進(jìn)行分組培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染，設(shè)置空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，以siErbB2組表示抑制ErbB2表達(dá)，以wortmannin組表示對(duì)PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路的抑制，并進(jìn)一步構(gòu)建siErbB2+IGF-1組驗(yàn)證假設(shè)推理。采用qRT-PCR和Western blot方法檢測各組細(xì)胞中ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。同時(shí)，應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞增殖、凋亡、遷移能力和侵襲能力的變化。本文研究結(jié)果顯示，siErbB2組和siErbB2+IGF-1組ErbB2表達(dá)明顯下降，而wortmannin組無明顯變化，說明RNA干擾可作為研究ErbB2在卵巢癌中作用的有效工具。

為進(jìn)一步了解ErbB2對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制。本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ErbB2基因沉默技術(shù)和通路抑制劑wortmannin處理卵巢癌細(xì)胞，檢測結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比較，siErbB2組和wortmannin組卵巢癌細(xì)胞中Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)量則顯著下降，Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著增加；而且與siErbB2組和wortmannin組相比，siErbB2+IGF-1組Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著上升。我們推測采用wortmannin抑制劑后，PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路效應(yīng)分子PI3K、Akt、eNOS活化狀態(tài)被抑制，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的低氧耐受和腫瘤微環(huán)境中的生存能力。

本文研究結(jié)果還表明，siErbB2組、wortmannin組和siErbB2+IGF-1組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力均下降，而細(xì)胞凋亡率上升。與siErbB2組和wortmannin組相比較，siErbB2+IGF-1組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力均上升，而細(xì)胞凋亡率下降。以上結(jié)果從PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路和細(xì)胞生物學(xué)特性兩個(gè)方面證實(shí)，ErbB2基因沉默或許可通過抑制PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖并能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路激活可發(fā)揮逆轉(zhuǎn)作用。提示ErbB2在卵巢癌的生長轉(zhuǎn)移的調(diào)控中可能發(fā)揮重要作用，且其分子機(jī)制與PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路密切相關(guān)。

PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、凋亡中的作用，既往有眾多報(bào)道。例如，LI等[27]報(bào)道，F(xiàn)GF21抑制劑可通過eNOS/PI3K/Akt信號(hào)通路抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移；AHSAN等[28]的結(jié)果顯示，磷酸肌酸可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/eNOS通路保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的凋亡的影響。目前針對(duì)ErbB2基因沉默通過PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響的研究較少，本文借助RNA干擾技術(shù)，從基因和蛋白水平證實(shí)ErbB2基因沉默可有效影響人卵巢癌細(xì)胞株HO8910細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為，提示ErbB2與卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)，且其可能機(jī)制與PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路的抑制有關(guān)。

綜上所述，本文的研究結(jié)果顯示，ErbB2在卵巢癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，RNA干擾技術(shù)可有效抑制ErbB2表達(dá)；ErbB2基因沉默可抑制PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路，從而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡。而PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路激活可逆轉(zhuǎn)ErbB2基因沉默作用，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果為臨床卵巢癌的基因治療提供了潛在依據(jù)。值得注意的是，本研究以細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究ErbB2在卵巢癌中的作用及其與PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路相關(guān)的分子機(jī)制，有待進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床驗(yàn)證。同時(shí)，抑制ErbB2在卵巢癌中的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用是否受到其他信號(hào)通路的影響，均為本研究未來探討的方向。