潘東,馬澤剛

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是一種中老年人常見的、緩慢進(jìn)行的神經(jīng)退行性疾病。PD常見運(yùn)動(dòng)癥狀包括運(yùn)動(dòng)功能受損、運(yùn)動(dòng)緩慢、靜止性震顫及平衡障礙等[1]。

PD的病理學(xué)特征是黑質(zhì)(SN)多巴胺(DA)能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失和紋狀體(Str)內(nèi)DA的耗竭[2]。PD的發(fā)病機(jī)制與年齡老化、環(huán)境毒素、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥等因素有關(guān)，但到目前為止PD中腦DA能神經(jīng)元變性機(jī)制仍尚未明確[3]。近年來，更多的證據(jù)表明中腦DA能神經(jīng)元損傷是由中腦SN鐵聚積造成的[4-7]。PD病人SN鐵聚積是由于鐵轉(zhuǎn)入蛋白二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(DMT1)和鐵轉(zhuǎn)出蛋白(Fpn1)的表達(dá)調(diào)控失調(diào)導(dǎo)致的，通過免疫標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)，PD 病人SN區(qū)DA 能神經(jīng)元上DMT1的表達(dá)多于腹側(cè)中腦被蓋區(qū)(VTA)，這也提示SN鐵選擇性聚積受DMT1的表達(dá)調(diào)控[8-11]。大麻素Ⅱ型受體(CB2R)是一種G蛋白耦聯(lián)受體[12]。近期研究表明，CB2R在大腦的海馬、VTA、SN、Str等區(qū)都有表達(dá)[13]。藥理學(xué)研究表明，CB2R激活可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化并改善神經(jīng)退行性疾病中的神經(jīng)功能缺陷和延緩疾病的進(jìn)展[14-15]，CB2R現(xiàn)已成為 PD 等神經(jīng)退行性疾病的潛在治療靶點(diǎn)。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在SH-SY5Y細(xì)胞中有表達(dá)[16]。我們前期的研究顯示，激活CB2R可以減輕1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作用。為了研究激活SH-SY5Y細(xì)胞上CB2R發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制，本研究選用MPP+處理的 SH-SY5Y 細(xì)胞作為PD細(xì)胞模型，觀察使用特異性CB2R 激動(dòng)劑 JWH133 激活CB2R對(duì)細(xì)胞鐵水平和DMT1表達(dá)的影響，以及CB2R 抑制劑AM630對(duì) CB2R特異性激活的阻斷效應(yīng)，確定激活CB2R是否可以通過調(diào)控DMT1 的表達(dá)而調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵水平。

1 材料與方法

1.1 試劑及其來源

二甲基亞砜(DMSO)、MPP+、硫酸亞鐵、維生素C、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、鈣黃綠素購自美國Sigma-Aldrich公司；DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)購自以色列Biological Industries公司；青霉素/鏈霉素混合液(100×)購自索萊寶公司；JWH133和AM630購自美國Tocris Bioscience公司；DMT1抗體購自美國OriGene公司；β-actin抗體購自博奧森生物公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自聯(lián)科生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

在溫度37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含體積分?jǐn)?shù)0.05的FBS和體積分?jǐn)?shù)0.01青霉素/鏈霉素的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞。將JWH133和AM630溶于DMSO中，制成儲(chǔ)備溶液(1 mmol/L)，加藥以前用培養(yǎng)液稀釋為工作溶液。將細(xì)胞分為對(duì)照組(A組)、MPP+組(B組)、JWH133+MPP+組(C組)和AM630+JWH133+MPP+組(D組)。對(duì)照組細(xì)胞用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；MPP+組細(xì)胞用含有1 mmol/L MPP+的培養(yǎng)液處理24 h；JWH133+MPP+組細(xì)胞用含有1 μmol/L JWH133的培養(yǎng)液先預(yù)處理30 min，然后再加入1 mmol/L MPP+共處理24 h；AM630+JWH133+MPP+組細(xì)胞用含有1 μmol/L JWH133和1 μmol/L AM630的培養(yǎng)液先預(yù)處理30 min，然后再加入1 mmol/L MPP+共處理24 h。

1.3 細(xì)胞鐵水平檢測(cè)

各組細(xì)胞藥物處理結(jié)束后，吸凈培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，用HBS漂洗3次后每孔加入500 μL鈣黃綠素，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，再用HBS漂洗3次。將玻片置于含有HBS的灌流槽中，調(diào)節(jié)激光掃描共聚焦顯微鏡物鏡找到合適的觀察視野，將灌流槽中的HBS緩慢吸出，加入500 μL硫酸亞鐵溶液，設(shè)置顯微鏡的激發(fā)光波長為488 nm，在X-Y-T模式下掃描，30 min后觀察SH-SY5Y細(xì)胞鈣黃綠素的熒光強(qiáng)度。

1.4 免疫印跡法檢測(cè)DMT1蛋白的表達(dá)

各組細(xì)胞藥物處理結(jié)束后，吸凈培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL裂解液處理30 min。吸取底部蛋白置于EP管中，在4 ℃條件下以12 000 r/min離心30 min，取上清80 μL。每組蛋白的上樣量為25 μg，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用50 g/L的脫脂奶粉封閉2 h，加入相應(yīng)一抗溶液后置于搖床上在4 ℃條件下孵育16 h，使用TBST漂洗4次(每次5 min)，加入二抗溶液室溫孵育1 h，使用TBST漂洗4次(每次5 min)，用ECL顯影液顯影。目的蛋白的表達(dá)以DMT1與β-actin條帶灰度值的比值表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 JWH133對(duì) MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞鐵水平的影響

鈣黃綠素在細(xì)胞內(nèi)可以發(fā)出綠色熒光，與細(xì)胞內(nèi)的鐵離子結(jié)合后可導(dǎo)致熒光淬滅，故細(xì)胞內(nèi)的鐵水平可以用熒光強(qiáng)度表示。用1 mmol/L的硫酸亞鐵溶液灌流SH-SY5Y細(xì)胞后，與對(duì)照組相比較，MPP+組細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯降低，差異有顯著性(F=26.620，q=10.410，P<0.05)；用CB2R激動(dòng)劑JWH133預(yù)處理后，JWH133+MPP+組細(xì)胞熒光淬滅程度低于MPP+組，差異有顯著性(q=4.868，P<0.05)；而且應(yīng)用CB2R抑制劑AM630可逆轉(zhuǎn)JWH133的這種作用，AM630+JWH133+MPP+組和JWH133+MPP+組熒光強(qiáng)度相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.619，P<0.05)；而AM630+JWH133+MPP+組熒光強(qiáng)度與MPP+組相比較，差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.751，P>0.05)。表明JWH133可以通過激活CB2R來抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的鐵水平升高。見表1。

2.2 JWH133對(duì)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞DMT1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，MPP+組細(xì)胞的DMT1蛋白表達(dá)量升高，差異有顯著性(F=9.493，q=4.109，P<0.05)；用JWH133預(yù)處理后，JWH133+MPP+組細(xì)胞DMT1蛋白表達(dá)量下降，與MPP+組相比差異具有顯著性(q=4.771，P<0.05)；而AM630可阻斷JWH133的作用，AM630+JWH133+MPP+組細(xì)胞的DMT1蛋白表達(dá)量較JWH133+MPP+組顯著升高(q=6.240，P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度和DMT1蛋白表達(dá)比較

3 討 論

PD是第二常見的神經(jīng)退行性疾病，隨著社會(huì)老齡化的加劇，PD在中老年人群中患病率成倍增加，老年人群中65歲以上者的患病率為1%～2%，85歲以上者的患病率為3%～5%[17]。越來越多的研究表明，CB2R在PD中起著非常重要的作用。有研究在PD病人的SN區(qū)發(fā)現(xiàn)酪氨酸羥化酶(TH)與CB2R共表達(dá)，并且PD病人SN區(qū)CB2R的表達(dá)下降[18]。使用CB2R的選擇性激動(dòng)劑(HU-308)可以減少脂多糖誘導(dǎo)的小鼠Str和SN區(qū)DA能神經(jīng)元死亡[19]。在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)損傷的模型小鼠中使用CB2R激動(dòng)劑AM1241，可以減少M(fèi)PTP對(duì)DA能神經(jīng)元的損傷作用[20]。以上結(jié)果均證實(shí)激活CB2R對(duì)PD具有保護(hù)作用。

有研究表明，腦內(nèi)鐵含量與PD的進(jìn)展有著密切的聯(lián)系，運(yùn)動(dòng)障礙越嚴(yán)重的PD病人，其SN區(qū)的鐵含量就越多[21-22]。鐵元素是人體不可或缺的微量元素，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種代謝過程都需要鐵參與，鐵在SN區(qū)聚積可以通過催化過氧化氫(H2O2)產(chǎn)生羥自由基和促進(jìn)α-突觸核蛋白原纖維的形成導(dǎo)致DA能神經(jīng)元的死亡[23]。大麻素可以通過激活CB2R抑制HEK293T細(xì)胞對(duì)鐵的攝入[24]，激活原代星形膠質(zhì)細(xì)胞上的CB2R可以減少進(jìn)入細(xì)胞鐵的數(shù)量[25]。本研究采用激光掃描共聚焦顯微鏡分析技術(shù)檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)功能情況，結(jié)果顯示，MPP+損傷可以導(dǎo)致細(xì)胞鐵水平升高，預(yù)先使用JWH133處理細(xì)胞可使細(xì)胞鐵水平明顯降低，進(jìn)一步使用CB2R拮抗劑AM630進(jìn)行阻斷驗(yàn)證，證實(shí)使用JWH133激活SH-SY5Y細(xì)胞的CB2R可以減少進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)鐵的數(shù)量，從而可能減輕鐵聚積對(duì)細(xì)胞的損傷作用。

研究證實(shí)，PD病人中腦SN區(qū)DMT1表達(dá)顯著升高[26]，激活CB2R可以抑制MPP+誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中DMT1表達(dá)上調(diào)[25]。DMT1基因突變可以減弱MPTP和6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用，激活CB2R可以通過DMT1磷酸化水平的降低減少轉(zhuǎn)入細(xì)胞鐵的數(shù)量，并且該作用可能是通過調(diào)控cAMP-PKA信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的[27-28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用JWH133預(yù)處理激活CB2R可以拮抗MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的DMT1蛋白表達(dá)上調(diào)，使用CB2R拮抗劑AM630可以阻斷JWH133的作用則更加明確激活CB2R可以調(diào)控DMT1蛋白的表達(dá)。但激活CB2R是如何調(diào)控細(xì)胞DMT1蛋白表達(dá)的機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。