李浩然,遲曉琦,吳雪,張文秀,韓曉華

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,山東 青島 266071)

心肌缺血通常由冠狀動(dòng)脈的狹窄或阻塞所引發(fā)。心肌組織中血流的減少或者阻斷會(huì)引起冠狀動(dòng)脈所支配區(qū)域的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給和氧氣供應(yīng)減少，最終使心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死[1-2]。但是缺血部位心肌組織的血供恢復(fù)后，由于細(xì)胞內(nèi)活性氧增多、鈣離子失衡、細(xì)胞能量代謝異常、炎癥反應(yīng)等原因[3]，會(huì)使得心肌細(xì)胞遭受更為嚴(yán)重的損傷[4]，即缺血-再灌注(I/R)損傷。I/R損傷通常會(huì)引發(fā)心肌頓抑、室內(nèi)壓下降等心肌功能的抑制，其預(yù)防與治療長(zhǎng)期以來(lái)都是心血管研究領(lǐng)域的重要課題。7,8-二羥基黃酮(7,8-DHF)是黃酮化合物之一。最近有研究表明，7,8-DHF是酪氨酸激酶B(TrkB)受體的特異性激動(dòng)劑[5]，具有強(qiáng)大的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用[6]。在心血管疾病的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，苯腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈收縮可被7,8-DHF顯著抑制, 而且該作用與降低細(xì)胞內(nèi)鈣水平和激活一氧化氮/環(huán)鳥苷酸信號(hào)通路有關(guān)[7]。此外，7,8-DHF還能拮抗過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8]。但是7,8-DHF對(duì)I/R損傷是否具有保護(hù)作用尚未見報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)進(jìn)行結(jié)扎處理，建立心肌I/R損傷的動(dòng)物模型，探討恢復(fù)血供前7,8-DHF預(yù)處理對(duì)再灌注心肌是否具有保護(hù)作用，并初步探討可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品和儀器

7,8-DHF(D1916)購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社?？笲cl-2抗體(AB112)、抗Bax抗體(AF0057)和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司，抗cleaved caspase-3(CST-9661)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，抗β-actin抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)公司，實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。所用實(shí)驗(yàn)儀器包括小動(dòng)物呼吸機(jī)(型號(hào)ALC-V8，上海奧爾科特生物科技有限公司)、Eppendorf高速離心機(jī)、SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀、微量分析天平和Western 顯影儀等。

1.2 動(dòng)物分組及處理

實(shí)驗(yàn)選用8～10周齡的雄性Wistar大鼠18只，體質(zhì)量(250±10)g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司(許可證號(hào)：SCXK(魯)20190003)。實(shí)驗(yàn)開始前，大鼠先在23～25 ℃、12 h/12 h明暗周期環(huán)境下飼養(yǎng)7 d，自由飲水和進(jìn)食。造模前，大鼠先禁食12 h，期間自由飲水。將大鼠隨機(jī)分為3組，每組6只。①假手術(shù)組(Sham組，A組)：大鼠麻醉并且固定后，通過(guò)口腔接入呼吸機(jī)輔助其呼吸；打開胸腔，將縫合線穿過(guò)LAD下方但不結(jié)扎，20 min后腹腔注射含體積分?jǐn)?shù)0.05二甲基亞砜(DMSO)的磷酸鹽緩沖液(PBS)，10 min后縫合傷口。②I/R組(B組)：開胸，結(jié)扎LAD 20 min后腹腔注射含體積分?jǐn)?shù)0.05 DMSO的PBS，10 min后取出結(jié)扎線，即缺血30 min后恢復(fù)血供。③I/R+7,8-DHF組(C組)：在結(jié)扎LAD 20 min后腹腔注射7,8-DHF(10 mg/kg)，其他處理與I/R組相同。所有大鼠均在恢復(fù)血供3 h后處死。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用標(biāo)準(zhǔn)和倫理學(xué)要求。

1.3 血清及心肌標(biāo)本制備

大鼠心臟恢復(fù)血供3 h后，通過(guò)尾靜脈取血約1.0 mL，先存放于4 ℃冰箱中靜置1 h，隨后再以3 000 r/min離心15 min，分離血清于新EP管中，凍存于-80 ℃冰箱備用。將心臟快速取出，放入預(yù)冷的PBS中清洗，保留結(jié)扎線以下的部分，剪去右心室，其余部分(左心室為主)用液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活力檢測(cè)

血清標(biāo)本送至海軍青島第一療養(yǎng)院檢驗(yàn)科測(cè)定。血清中LDH的活力采用速率法測(cè)定，CK-MB的活力采用免疫抑制法測(cè)定。

1.5 心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)蛋白的Western blot檢測(cè)

取20～30 mg心肌組織，將其充分剪碎后放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入200～300 μL蛋白裂解液充分研磨，以12 000 r/min離心20 min，留取上清液，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。每個(gè)樣本的蛋白上樣量均為20 μg，蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用100 g/L脫脂奶粉室溫慢搖封閉90 min，分別加入抗Bcl-2抗體(1∶1 000)、抗Bax抗體(1∶1 000)、抗cleaved caspase-3抗體(1∶1 000)和抗β-actin抗體(1∶10 000)。在4 ℃冰箱內(nèi)的搖床上慢速搖動(dòng)孵育過(guò)夜，隨后以TBST洗膜3次，每次10 min，再加入二抗，室溫孵育1 h后，以TBST洗膜3次，最后用ECL發(fā)光液顯影。用軟件Image J對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析。結(jié)果以目的蛋白灰度值與相對(duì)應(yīng)的β-actin灰度值的比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 7,8-DHF對(duì)血清LDH和CK-MB活力的影響

與Sham組相比，I/R組大鼠血清中LDH的活力升高了35%(F=18.770，q=7.167，P<0.01)；與I/R組相比，I/R+7,8-DHF組LDH活力下降了28%(q=7.800，P<0.01)。血清CK-MB活力的變化與LDH類似，與Sham組相比較，I/R組大鼠血清中CK-MB的含量升高了71%(F=5.422，q=4.240，P<0.05)。與I/R組大鼠相比，I/R+7,8-DHF組CK-MB活力下降了37%(q=3.788，P<0.05)。提示7,8-DHF抑制了I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。見表1。

表1 各組大鼠血清LDH和CK-MB活力的比較

2.2 7,8-DHF對(duì)心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)蛋白表達(dá)影響

與Sham組相比，I/R組大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低(F=6.217，q=4.698，P<0.05)，Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加(F=14.720、7.653，q=7.546、4.975，P<0.01)，表明I/R損傷會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。與I/R組相比，I/R+7,8-DHF組Bcl-2蛋白表達(dá)升高了86%(q=3.797，P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)減少了45%(q=4.977，P<0.01)，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)減少了42%(q=4.584，P<0.05)，說(shuō)明7,8-DHF有效抑制了I/R損傷造成的心肌細(xì)胞凋亡。見表2和圖1。

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)蛋白表達(dá)的比較

A：sham組；B：I/R組；C：I/R+7,8-DHF組。

3 討 論

急性心肌梗死(AMI)通常由冠狀動(dòng)脈內(nèi)血流急劇減少或中斷造成，會(huì)導(dǎo)致心肌組織中血液供應(yīng)的減少，從而引發(fā)嚴(yán)重后果。近年來(lái)AMI的防治已取得較大進(jìn)展[9]，但是缺血后的心肌組織在血流恢復(fù)之后，依然會(huì)出現(xiàn)生理功能的進(jìn)一步損傷，稱為心肌I/R損傷。I/R損傷會(huì)導(dǎo)致心肌頓抑、心律失常和心肌壞死等惡性后果，其預(yù)防與治療一直是AMI治療中的重要環(huán)節(jié)，但是目前還無(wú)特別有效的防治方法。

心肌I/R損傷存在明顯的心肌細(xì)胞凋亡，這可能與氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[10-11]。細(xì)胞凋亡受到多種信號(hào)通路和蛋白的調(diào)控。Bcl-2和Bax均屬于Bcl-2家族蛋白成員，Bax蛋白形成二聚體后可增加線粒體膜通透性，促進(jìn)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2蛋白則通過(guò)抑制Bax二聚體形成抑制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡中最重要的效應(yīng)酶是caspase-3，它激活后可以裂解形成分子量為17 000～19 000的片段，稱為cleaved caspase-3。所以通過(guò)檢測(cè)Bcl-2、Bax以及cleaved caspase-3蛋白水平，可以評(píng)估心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。

7,8-DHF是黃酮家族中的一員，具有神經(jīng)保護(hù)[13]、抗氧化[14]、抗炎癥[15]、抗腫瘤[16]、抗增殖[17]等多種生物學(xué)作用。黃酮類化合物的心血管保護(hù)作用已有較多研究[18]。例如，黃芩苷可通過(guò)激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)途徑以及抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥[19]，從而抑制心肌I/R損傷。但是，7,8-DHF對(duì)I/R造成的心肌組織損傷是否具有保護(hù)作用尚無(wú)相關(guān)研究。

心肌細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)的某些酶釋放入血，血清中這些酶活力的升高程度則反映出了心肌壞死的程度[20]。本研究首先通過(guò)測(cè)定血清中LDH和CK-MB的變化，觀察7,8-DHF預(yù)處理對(duì)缺血心肌損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，I/R組大鼠血清中LDH和CK-MB的活力均明顯升高，7,8-DHF預(yù)處理則部分抑制了上述變化，提示7,8-DHF預(yù)處理對(duì)再灌注的心肌組織具有一定的保護(hù)作用。為了進(jìn)一步探討7,8-DHF保護(hù)作用的機(jī)制，本研究通過(guò)檢測(cè)Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)來(lái)評(píng)估心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[21]。結(jié)果顯示，I/R組大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)升高，提示I/R大鼠心肌存在明顯的細(xì)胞凋亡，7,8-DHF預(yù)處理可顯著逆轉(zhuǎn)上述變化，進(jìn)一步驗(yàn)證了7,8-DHF的心肌保護(hù)作用，并且表明該作用與其抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究結(jié)果為7,8-DHF應(yīng)用于心肌I/R損傷的防治提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。