李勝軍,張璐璐,李靜,王宏偉,劉世國(guó),孫鵬

(1 青島大學(xué)附屬青島市婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東 青島 266034； 2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院新生兒科；3 青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科； 4 青島大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心)

子癇前期(PE)是指妊娠20周后首次出現(xiàn)的以高血壓、蛋白尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)的臨床綜合征[1]，近年來(lái)PE發(fā)病率呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)，由于其可伴發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥，如心力衰竭、HELLP綜合征等，成為導(dǎo)致孕產(chǎn)婦不良預(yù)后的重要原因。研究表明，胚胎在子宮內(nèi)附著、存活須憑借母-胎間的免疫耐受平衡[2]，攜帶父方來(lái)源的胎兒基因與母體的基因沖突使得滋養(yǎng)細(xì)胞侵入障礙、胎盤(pán)淺著床從而導(dǎo)致PE的發(fā)生[3]。人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)可在妊娠過(guò)程中抑制子宮內(nèi)膜自然殺傷細(xì)胞的活性，進(jìn)而維持母胎之間免疫平衡。HLA-DR抗原是HLA基因系統(tǒng)中的重要抗原之一，決定其特異性的主要編碼基因DRB1座位具有高度多態(tài)性。目前研究認(rèn)為，HLA-DRB1基因相關(guān)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4-6]。其中HLA-DRB1rs3135388位點(diǎn)位于5′非翻譯區(qū)，有研究證實(shí)其SNP與多發(fā)性硬化癥有明確的相關(guān)性[7-8]；rs2308765位點(diǎn)的SNP可導(dǎo)致錯(cuò)義突變(由半胱氨酸突變?yōu)楸奖彼?，與腦血管疾病相關(guān)[9]；rs2213586位點(diǎn)目前仍處于研究階段，其功能未知。然而，這3個(gè)位點(diǎn)的SNP與重度PE是否具有相關(guān)性目前尚無(wú)報(bào)道。本文研究通過(guò)對(duì)產(chǎn)婦HLA-DRB1基因的3個(gè)位點(diǎn)rs3135388、rs2308765及rs2213586進(jìn)行基因型及等位基因頻率分析，探討HLA-DRB1基因SNP與重度PE的相關(guān)性，以期為重度PE的診斷及治療提供遺傳學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2016年6月—2017年8月，選取在青島大學(xué)附屬醫(yī)院分娩的重度PE產(chǎn)婦60例(子癇組)，年齡20～46歲，平均(33.67±5.42)歲。重度PE診斷參照相關(guān)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[10]，滿(mǎn)足下列任何一種情況即可診斷：①收縮壓≥21.28～23.94 kPa，或舒張壓≥14.63 kPa；②24 h尿蛋白>5.0 g或隨機(jī)尿蛋白以上；③中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，精神狀態(tài)改變和嚴(yán)重頭痛(頻發(fā)，常規(guī)鎮(zhèn)痛藥不緩解)；④腦血管意外；⑤視力模糊，眼底點(diǎn)狀出血，極少數(shù)病人發(fā)生皮質(zhì)性盲；⑥肝細(xì)胞功能障礙，肝細(xì)胞損傷，血清轉(zhuǎn)氨酶至少升高2倍；⑦上腹部或右上象限痛等肝包膜腫脹癥狀，肝被膜下出血或肝破裂；⑧少尿，24 h尿量<500 mL，肺水腫、心力衰竭；⑨血小板<100×109/L；⑩凝血功能障礙；微血管病性溶血(血清乳酸脫氫酶升高)；胎兒生長(zhǎng)受限、羊水過(guò)少、胎盤(pán)早剝。選取同期正常妊娠的產(chǎn)婦100例作為對(duì)照組，年齡22～44歲，平均(30.74±4.60)歲。兩組研究對(duì)象既往均無(wú)原發(fā)性高血壓、內(nèi)分泌疾病、心力衰竭、急慢性腎炎以及癌癥等病史。本文研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1臨床資料采集 根據(jù)知情同意原則收集研究對(duì)象的臨床資料，包括產(chǎn)婦孕產(chǎn)次、血壓及新生兒胎齡、體質(zhì)量、生后1 min Apgar評(píng)分等。

1.2.2HLA-DRB1相關(guān)SNP位點(diǎn)測(cè)序 采集研究對(duì)象外周血，應(yīng)用Promega DNA純化試劑盒提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增目的片段，引物由美國(guó)Applied Biosystems(ABI, New York, USA)生物公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見(jiàn)表1。對(duì)目的片段進(jìn)行直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果由BioEdit Sequence Alignment Editor讀出，不能讀取結(jié)果或結(jié)果模棱兩可時(shí)進(jìn)行反向測(cè)序[11]，分析基因型及等位基因頻率。

表1 PCR引物及其序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較

子癇組產(chǎn)婦年齡、收縮壓和舒張壓均高于對(duì)照組，子癇組新生兒胎齡、出生體質(zhì)量及1 min Apgar評(píng)分均低于對(duì)照組，差異有顯著性(t=-22.12～34.78，P<0.05)。子癇組產(chǎn)婦的生產(chǎn)次數(shù)(產(chǎn)次)、懷孕次數(shù)(孕次)與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 子癇組和對(duì)照組臨床資料比較

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

對(duì)照組HLA-DRB1基因rs3135388位點(diǎn)(χ2=0.066，P=0.798)、rs2308765位點(diǎn)(χ2=0.000，P=1.000)及rs2213586位點(diǎn)(χ2=1.355，P=0.244)的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，即P>0.05，認(rèn)為群體遵循遺傳規(guī)律，所得數(shù)據(jù)具有良好的群體代表性。

2.3 兩組HLA-DRB1 rs3135388、rs2308765以及rs2213586位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較

本研究?jī)山M均未發(fā)現(xiàn)rs2308765位點(diǎn)的SNP。

子癇組與對(duì)照組HLA-DRB1rs3135388基因型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.678，P=0.432)，兩種等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.688，P=0.407，OR=0.590，95%CI=0.167～2.081)。子癇組與對(duì)照組HLA-DRB1rs2213586位點(diǎn)基因型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.600，P=0.061)，兩種等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.687，P=0.407，OR=1.310，95%CI=0.691～2.484)。見(jiàn)表3、4。

表3 兩組 rs3135388位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較

表4 兩組rs2213586位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較

3 討 論

PE是一種妊娠期的特發(fā)性疾病，而重度PE常可引發(fā)心力衰竭、肺水腫、HELLP綜合征等，進(jìn)而導(dǎo)致孕產(chǎn)婦的不良預(yù)后；同時(shí)由于孕期胎盤(pán)功能不良，母體與胎兒物質(zhì)交換障礙，可致胎兒生長(zhǎng)受限、早產(chǎn)、低出生體質(zhì)量及生后窒息低氧等[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，PE孕婦與正常對(duì)照組HLA-DRB1的表達(dá)存在明顯差異[14]，該基因的多態(tài)性與重度PE的發(fā)生存在緊密聯(lián)系[15]。

PE屬于妊娠高血壓疾病，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高血壓具有明顯的家族聚集傾向，病人一級(jí)近親屬發(fā)生高血壓的風(fēng)險(xiǎn)較對(duì)照組增加約5倍[16]，提示遺傳因素在疾病的發(fā)病過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[17]。此外，已有研究顯示，PE可以看作母體對(duì)胎兒的同種移植物的免疫排斥反應(yīng)，而母體與胎兒間免疫失衡導(dǎo)致的胎盤(pán)功能不良與PE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18-20]。HLA是器官移植期間導(dǎo)致移植排斥反應(yīng)發(fā)生的重要組織相容性抗原，在人體免疫應(yīng)答期間發(fā)揮著重要的作用。妊娠過(guò)程中，HLA在介導(dǎo)母兒免疫耐受中起著重要作用，可以防止母體對(duì)胎兒的免疫攻擊，而且還能與特定受體結(jié)合后促進(jìn)血管生長(zhǎng)因子的分泌，促進(jìn)胎盤(pán)血管的正常滋生以及胚胎組織向子宮內(nèi)膜的安全著床[21]。HLA-DR抗原是HLA基因系統(tǒng)中最重要的抗原之一，決定其特異性的主要編碼基因DRB1座位具有高度多態(tài)性，目前多項(xiàng)研究證實(shí)該區(qū)域的基因多態(tài)性與PE的發(fā)生密切相關(guān)。HAYWARD等[22]和吳乾渝等[23]研究發(fā)現(xiàn)，PE病人HLA-DRB1*06和HLA-DRB1*07及其新生兒HLA-DRB1*07出現(xiàn)的頻率顯著高于正常對(duì)照組。劉國(guó)成等[15]通過(guò)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，HLA-DRB1*03基因的多態(tài)性與妊娠期高血壓具有相關(guān)性。

本研究采用PCR直接測(cè)序法檢測(cè)HLA-DRB1單個(gè)核苷酸變異對(duì)PE發(fā)病的影響。結(jié)果顯示，子癇組和對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)rs2308765位點(diǎn)的SNP，而兩組rs3135388及rs2213586位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明這兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性可能與PE遺傳易感性不相關(guān)。分析其原因，可能與本研究樣本量偏小以及等位基因與基因頻率的連鎖不平衡有關(guān)。此外，妊娠期高血壓作為環(huán)境與遺傳因素共同起作用的疾病，其發(fā)病可能與多種基因聯(lián)合作用相關(guān)。因此，本研究尚不能認(rèn)為HLA-DRB1rs2308765、rs3135388、rs2213586位點(diǎn)SNP與重度PE有相關(guān)性。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、檢測(cè)其他相關(guān)基因，進(jìn)行單倍型分析和多位點(diǎn)聯(lián)合分析,或?qū)橄乱徊窖芯康闹攸c(diǎn)。