孫華，肖開(kāi)永，劉利君

急性心肌梗死（AMI）是指冠狀動(dòng)脈（冠脈）急性、持續(xù)性缺血缺氧所導(dǎo)致的心肌壞死，可導(dǎo)致惡性心律失常、休克或心力衰竭等，嚴(yán)重威脅患者的生命安全[1]。研究表明，心肌纖維化為心力衰竭（心衰）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，AMI后阻斷心肌纖維化進(jìn)程是防治心衰的關(guān)鍵，而心肌纖維化與炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡有關(guān)[2]。瑞舒伐他汀是他汀類降血脂藥，其在抑制氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、心肌纖維化等方面作用逐漸被證實(shí)[3]。本研究擬通過(guò)探討瑞舒伐他汀對(duì)AMI大鼠血清C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎性因子及組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase-3表達(dá)情況影響，為其治療相關(guān)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 40只雄性清潔級(jí)健康SD大鼠，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，平均（220±20）g；瑞舒伐他汀[阿斯利康藥業(yè)（中國(guó)）有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20170008，規(guī)格：10 mg]；大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；SP免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗大鼠caspase-3多克隆抗體購(gòu)自艾美捷科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型構(gòu)建及分組 根據(jù)文獻(xiàn)[4]步驟構(gòu)建大鼠AMI模型：腹腔注射3%戊巴比妥鈉，固定四肢，氣管插管，插管遠(yuǎn)端連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，四肢皮下連接心電記錄儀，第3肋肋間離斷行開(kāi)胸術(shù)，充分暴露心臟，左心耳下進(jìn)針縫扎前降支。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎處左心室組織呈蒼白色，心電圖ST-T段呈弓背上抬高。無(wú)出血后，逐層縫合關(guān)胸。Sham組大鼠僅行前降支穿線而不結(jié)扎。術(shù)后24 h再行心電圖檢查證實(shí)AMI情況。建模成功后將術(shù)后24 h內(nèi)存活的21只模型大鼠隨機(jī)分為模型組（Model組，10只）、瑞舒伐他汀組（11只）。術(shù)后1 d起，Sham、Model組予以1 mg/kg·d生理鹽水灌胃處理，瑞舒伐他汀組予以1 mg/kg·d瑞舒伐他汀灌胃處理，連續(xù)用藥4周。

1.2.2 標(biāo)本采集 血清標(biāo)本：大鼠麻醉后，采集3 ml心臟血，3000 r/min離心處理15 min，分離血清，于-80℃冷存待檢。組織標(biāo)本：干預(yù)4周后，大鼠麻醉稱重，斷頭處死，快速開(kāi)胸，摘除心臟，生理鹽水反復(fù)沖洗，采集近基底部梗死區(qū)心肌組織，置入中性福爾馬林溶液內(nèi)固定24 h，石蠟包埋，制成4 μm切片。

1.2.3 血清CRP、TNF-α、IL-6水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)待測(cè)血清標(biāo)本中的CRP、TNF-α、IL-6水平，采用美國(guó)Bio Tek ELx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)得待測(cè)標(biāo)本吸光度（OD）值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)品回歸曲線，以O(shè)D值計(jì)算出待測(cè)標(biāo)本濃度，嚴(yán)格按照試劑盒及儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4 心肌組織caspase-3基因表達(dá)檢測(cè) caspase-3蛋白檢測(cè)：免疫組化SP法：①石蠟切片，常規(guī)脫蠟；②高壓抗原修復(fù)；③阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；④滴加羊血清封閉；⑤滴加采用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）稀釋至1:100兔抗大鼠caspase-3一抗，PBS沖洗；⑥滴加經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗；⑦滴加鏈霉素抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶（SP）；⑧二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色；⑨蘇木素復(fù)染；⑩脫水、透明、封片、鏡檢。設(shè)置PBS代替一抗為陰性對(duì)照。每份標(biāo)本取3張切片，顯微鏡下評(píng)估caspase-3蛋白表達(dá)情況，判定標(biāo)準(zhǔn)[5]為：細(xì)胞核、細(xì)胞漿內(nèi)存在棕黃色、棕褐色顆粒即為陽(yáng)性。采用病理圖形文字分析軟件測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)區(qū)，每張切片選擇4個(gè)陽(yáng)性表達(dá)區(qū)內(nèi)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)caspase-3蛋白陽(yáng)性染色，該數(shù)值代表caspase-3基因蛋白表達(dá)水平，蛋白陽(yáng)性指數(shù)（PI）=（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)）×100%。

caspase-3基因半定量分析：RT-PCR法：總RNA提取及cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成均按照文獻(xiàn)[6]所述進(jìn)行。PCR擴(kuò)增：檢索基因庫(kù)中大鼠caspase-3基因的cDNA序列，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為：caspase-3：上游引物：5’-CTGGACTG CGGTATTGAGAC-3’，下游引物：5’-CCGGGT GCGGTAGAGTAAGC-3’，β-actin：上游引物：5’-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’，下游引物：5’-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3’。反應(yīng)體系為：2.5 μl cDNA+2.5 μl PCR緩沖液+0.1 μl上游引物+0.1 μl下游引物+7.2 μl滅菌水+0.1 μl Taq酶+2 μl dNTP。反應(yīng)條件為：預(yù)變性：95℃，40 s→60℃，40 s→72℃，1 min，共36個(gè)循環(huán)，再72℃反應(yīng)10 min冷存待檢。以caspase-3/β-actin值表示caspase-3基因的mRNA表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件處理。正態(tài)分布計(jì)量資料以（±s）表示，三組間比較行單因素方差分析，兩兩對(duì)比采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清CRP、TNF-α、IL-6水平比較 結(jié)果顯示，Model組、瑞舒伐他汀組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平均高于Sham組，瑞舒伐他汀組血清CRP、TNF-α、IL-6水平均低于Model組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），（表1、圖1）。

2.2 三組心肌組織caspase-3基因表達(dá)情況比較 結(jié)果顯示，Model組、瑞舒伐他汀組大鼠心肌組織caspase-3蛋白陽(yáng)性指數(shù)、mRNA表達(dá)水平均高于Sham組大鼠，而瑞舒伐他汀組大鼠心肌組織caspase-3蛋白陽(yáng)性指數(shù)、mRNA表達(dá)水平均低于Model組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），（表2、圖2）。

表1 三組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比較

圖1 三組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比較

表2 三組大鼠心肌組織caspase-3蛋白陽(yáng)性指數(shù)、mRNA表達(dá)水平比較

圖2 三組大鼠心肌組織caspase-3蛋白陽(yáng)性指數(shù)、mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

心力衰竭是包括AMI在內(nèi)的多種心血管疾病終末階段，死亡率較高。研究顯示，心力衰竭誘發(fā)心肌細(xì)胞外基質(zhì)纖維化及心肌細(xì)胞損傷為AMI患者心功能惡化的基礎(chǔ)病因[7]。心肌損傷時(shí)，其成纖維細(xì)胞大量分泌并生成肌成纖維細(xì)胞，而肌成纖維細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生過(guò)量膠原蛋白，致使心肌細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積，引發(fā)心肌纖維化，并最終引起心室重構(gòu)，心功能惡化[8]。

既往研究認(rèn)為，他汀類藥物主要用于降血脂，降低心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。近年研究顯示，他汀類藥物除降脂外還具有如抗動(dòng)脈粥樣硬化，抑制血栓形成、免疫應(yīng)答、氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡及改善心功能等多重效應(yīng)[9,10]。瑞舒伐他汀作為一類常用他汀藥物，具有比其他他汀藥物作用更強(qiáng)、作用時(shí)間更長(zhǎng)的特點(diǎn)。戚鳳君等[11]研究顯示，瑞舒伐他汀可明顯降低經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）后患者血清炎性因子水平。謝亞芹等[12]研究則表明，瑞舒伐他汀能明星降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠AMI模型，探討瑞舒伐他汀對(duì)AMI炎性因子及細(xì)胞凋亡的影響。

已有研究證實(shí)，炎性因子在AMI患者心肌纖維化進(jìn)程中扮演重要角色。CRP為一種急性時(shí)相蛋白，被證實(shí)和心力衰竭、心肌梗死、高血壓等發(fā)生有關(guān)。張立杰等[13]指出，CRP能以激活核轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1信號(hào)通路及上調(diào)血管緊張素Ⅱ受體水平參與炎性反應(yīng)，從而引發(fā)心肌纖維化。TNF-α為啟動(dòng)炎性反應(yīng)最為重要的細(xì)胞因子，也稱為前炎癥細(xì)胞因子。陳強(qiáng)等[14]表明，TNF-α?xí)种菩募∈湛s過(guò)程β受體活性及Ca2+活動(dòng)，誘使心肌細(xì)胞、間質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而損傷心肌功能。IL-6為一種主要由成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有多重效應(yīng)，在機(jī)體免疫代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用。陳澤江等[15]研究顯示，IL-6能誘導(dǎo)肝細(xì)胞分泌CRP，且此過(guò)程在炎癥早期便可發(fā)生，促使血栓形成及纖維蛋白原分泌而損傷心肌細(xì)胞；此外，IL-6還誘導(dǎo)TNF-α水平升高而致使血管、內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，促使局部黏附因子聚集，導(dǎo)致心肌纖維化。本研究表明，Model組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平明顯高于Sham組大鼠，而瑞舒伐他汀組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平明顯低于Model組，提示瑞舒伐他汀能降低血清CRP、TNF-α、IL-6水平，從而抑制心肌纖維化進(jìn)程，改善心肌功能。

張杰等[16]研究顯示，細(xì)胞凋亡與AMI發(fā)生有關(guān)。心肌細(xì)胞為不可再生細(xì)胞，AMI早期伴隨大量心肌細(xì)胞凋亡，而當(dāng)?shù)蛲鏊匠^(guò)周?chē)?xì)胞及局部巨噬細(xì)胞清除水平時(shí)，未被吞噬凋亡細(xì)胞會(huì)壞死、裂解，釋放大量炎性因子，造成心肌實(shí)質(zhì)細(xì)胞丟失，導(dǎo)致心室重構(gòu)，進(jìn)一步損傷心肌。細(xì)胞凋亡主要存在內(nèi)源性途徑及外源性途徑兩種相互關(guān)聯(lián)途徑，目前已發(fā)現(xiàn)caspase家族中的caspase-3參與了上述兩種途徑的細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程。caspase-3為細(xì)胞凋亡中級(jí)聯(lián)反應(yīng)最后通路，可直接引發(fā)細(xì)胞凋亡，也可通過(guò)破壞DNA修復(fù)相關(guān)酶、細(xì)胞骨架蛋白與其調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)，抑制DNA修復(fù)，促使細(xì)胞凋亡[17]。本研究表明，Model組大鼠心肌組織caspase-3蛋白陽(yáng)性指數(shù)、caspase-3 mRNA表達(dá)水平均明顯高于Sham組大鼠，而瑞舒伐他汀組大鼠心肌組織caspase-3蛋白陽(yáng)性指數(shù)、caspase-3 mRNA表達(dá)水平均明顯低于Model組大鼠，提示瑞舒伐他汀可明顯抑制caspase-3基因表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，瑞舒伐他汀可明顯降低急性心肌梗死大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平，抑制心肌纖維化，下調(diào)心肌組織中caspase-3基因表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善大鼠心肌功能。