王芮東，李楠，衛(wèi)博慧，杜文紅

(1.運(yùn)城學(xué)院 理科實(shí)驗(yàn)中心，山西 運(yùn)城 044000；2.運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000)

蘿卜泡菜是以蘿卜為原料，添加一定濃度的食鹽溶液，通過乳酸發(fā)酵而成的一種發(fā)酵食品，具有酸脆爽口、風(fēng)味獨(dú)特的特點(diǎn)[1-3]，富含膳食纖維、維生素、氨基酸及多種有機(jī)酸[4-6]，而有機(jī)酸是蘿卜泡菜中一種主要呈味物質(zhì)，其含量的多少與泡菜的發(fā)酵程度有直接關(guān)系[7-9]。

目前，高效液相色譜法(HPLC)用于泡菜中有機(jī)酸的檢測研究較少，李志華[10]采用HPLC同時測定泡芥菜、小尖椒、豆角液汁中草酸、酒石酸、乳酸等5種有機(jī)酸；葉陵等[11]采用自然、純菌種兩種方式發(fā)酵剁辣椒，并對其有機(jī)酸的含量進(jìn)行比較分析。

本試驗(yàn)建立了HPLC法同時測定蘿卜泡菜中7種有機(jī)酸含量的方法，對采用自然、老泡菜水和乳酸菌制劑3種發(fā)酵方式制作的蘿卜泡菜在第0～10 d發(fā)酵過程中有機(jī)酸的變化進(jìn)行了研究，比較采用不同發(fā)酵形式制作的泡菜在發(fā)酵過程中各有機(jī)酸的變化差異，有助于對泡菜的品質(zhì)進(jìn)行科學(xué)調(diào)控，為泡菜的深入研究提供了有效的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蘿卜、白砂糖、精鹽、各種調(diào)料：均購自運(yùn)城市沃爾瑪超市。

磷酸二氫鉀、磷酸(分析純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳酸、檸檬酸、草酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、甲醇(色譜純)：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC1200型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；PHS-3C酸度計(jì) 上海佑科儀器有限公司；S-1-150S高速離心機(jī) 鞏義市宏華儀器有限公司；KQ-2200超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜制備

1.3.1.1 基本配方

蘿卜500 g、水1000 mL、糖50 g、食鹽60 g、花椒20 g、干辣椒10 g、大蒜20 g、姜50 g、八角8 g。

1.3.1.2 工藝流程

1.3.1.3 操作要點(diǎn)

原料選擇及處理：挑選新鮮、無損害的蘿卜，洗凈、晾干后，均勻切分成1 cm×1 cm×5 cm大小的蘿卜塊。

鹵水配制：按配方比例在水中加入糖、食鹽等輔料，煮沸后冷卻備用。

裝壇：把蘿卜與鹵水一同加入泡菜壇中，加水密封。

1.3.1.4 發(fā)酵方式

自然發(fā)酵：按蘿卜與鹵水質(zhì)量比(下同)為1∶2裝壇，密封后發(fā)酵。

乳酸菌制劑發(fā)酵：按蘿卜與鹵水為1∶2的比例裝壇，并按泡菜總質(zhì)量的0.3%加入乳酸菌制劑。

老泡菜水發(fā)酵：按蘿卜∶鹵水為10∶19的比例裝壇，并加入總質(zhì)量3.5%的老泡菜水。

1.3.2 有機(jī)酸測定方法的建立

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)；檢測器：VWD檢測器；檢測波長：210 nm；流動相：0.01 mol/L磷酸二氫鉀∶甲醇為98∶2(磷酸調(diào)pH至2.5)；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.2.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取草酸10 mg、酒石酸40 mg，乳酸、蘋果酸、檸檬酸、乙酸各150 mg，琥珀酸350 mg，用流動相溶解并定容至25 mL容量瓶中，得到0.4 mg/mL草酸，1.6 mg/mL酒石酸，6 mg/mL蘋果酸、檸檬酸、乳酸、乙酸，14 mg/mL琥珀酸的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)母液，用流動相稀釋0，2，5，10，25，50倍經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)樣，以峰面積對質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品的預(yù)處理

按發(fā)酵蘿卜∶汁液為1∶1制取勻漿，稱取勻漿5 g加10 mL超純水，超聲處理20 min后9000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上機(jī)檢測[12-13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0、Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由表1可知，7種酸的相關(guān)系數(shù)均大于0.9971，表明7種有機(jī)酸的峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系很好，該條件下可進(jìn)行泡菜中有機(jī)酸的檢測。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性參數(shù)Table 1 The linear parameters of the standard curves of organic acids

2.2 精密度

將稀釋10倍的混標(biāo)連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其精密度為0.38%～1.67%，表明該法精密度較好，結(jié)果見表2。

表2 測定方法的精密度Table 2 The precision of testing methods

2.3 重復(fù)性

精密稱取乳酸菌制劑發(fā)酵泡菜第6天的樣品 6 份，按上述色譜條件上機(jī)分析，計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，其結(jié)果為0.53%～7.38%，說明該方法重現(xiàn)性好，結(jié)果見表3。

2.4 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱取乳酸菌制劑發(fā)酵第10天的樣品6份，將有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合液分高、中、低3個梯度(120%、100%、80%)加入樣品待測液中，預(yù)處理后進(jìn)行色譜分析，分別計(jì)算其加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率為92.8%～106.4%，說明該法精確度高，結(jié)果見表4。

表4 有機(jī)酸加標(biāo)回收率Table 4 The recovery rates of organic acids

2.5 泡菜中有機(jī)酸的分析

2.5.1 HPLC圖譜分析

有機(jī)酸混合標(biāo)樣及自然、乳酸菌制劑、老泡菜水3種發(fā)酵方式第4天泡菜的HPLC圖見圖 1。

圖1 有機(jī)酸混合標(biāo)樣(A)及自然(B)、乳酸菌制劑(C)和老泡菜水(D)發(fā)酵第4天泡菜的高效液相色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of pickles by organic acid mixed standard sample (A), natural (B), lactic acid bacteria preparation (C) and old pickle water (D) fermentation methods on the 4th day注：1為草酸；2為酒石酸；3為D-蘋果酸；4為乳酸；5為乙酸；6為L-蘋果酸；7為檸檬酸；8為琥珀酸。

由圖1可知，有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品、泡菜樣品中的各有機(jī)酸均能很好分離。

2.5.2 泡菜中7種有機(jī)酸的分析結(jié)果

3種發(fā)酵方式第0～10 d的泡菜樣品中7種有機(jī)酸含量見表5。

表5 3種發(fā)酵方式下蘿卜泡菜第0～10 d的有機(jī)酸含量Table 5 The organic acid content of pickled radish by three fermentation methods at the 0～10th day mg/mL

由表5可知，草酸含量在自然、乳酸菌制劑、老泡菜水3種發(fā)酵方式中均呈降低趨勢，且在第0～6 d顯著下降(p<0.05)，第6天后下降速度趨于平緩，發(fā)酵至第10天時分別降至(104.726±0.006)，(108.372±0.023)，(101.187±0.006) mg/mL，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于第0天的(306.815±0.055)，(312.533±0.041)，(287.544±0.111) mg/mL，這是由于蘿卜本身含有一定量草酸，發(fā)酵過程中會與醇類生成酯類物質(zhì)[14]。

酒石酸含量在3種發(fā)酵方式中均呈先下降后上升趨勢，在第0～8 d呈明顯下降趨勢(p<0.05)，分別由最高值(1.898±0.046)，(1.817±0.077)，(1.825±0.025) mg/mL下降至最低值(0.411±0.004)，(1.003±0.109)，(0.372±0.307) mg/mL后呈顯著上升趨勢(p<0.05)，且乳酸菌制劑發(fā)酵方式的下降幅度明顯低于其他兩種方式。

檸檬酸含量在自然、乳酸菌制劑發(fā)酵方式中呈先下降后上升趨勢，第0～4 d分別由(0.611±0.058)，(0.522±0.042) mg/mL降至最低值(0.123±0.026)，(0.127±0.003) mg/mL之后又上升至第10天的最高值(0.689±0.036)，(0.574±0.028) mg/mL，而在老泡菜水發(fā)酵中，發(fā)酵至第2天后均未檢出，這可能與老泡菜水中微生物的代謝有一定關(guān)系。

乳酸、乙酸含量在3種發(fā)酵方式中均呈上升趨勢，乳酸上升速度均高于乙酸。發(fā)酵至第10天，乳酸菌制劑發(fā)酵中的乳酸含量顯著高于其他兩種發(fā)酵(p<0.05)，分別為(10.147±0.011)，(8.283±0.025)，(5.384±0.285) mg/mL，這是由于乳酸菌制劑發(fā)酵中乳酸菌數(shù)量較多，通過乳酸菌的生長繁殖會產(chǎn)生更多的乳酸[15]；在第0～10 d的發(fā)酵過程中，乳酸菌制劑發(fā)酵中的乙酸含量均高于其他兩種方式，這是由于乳酸菌制劑發(fā)酵中醋酸菌數(shù)量多于其他兩種方式，通過醋酸發(fā)酵會產(chǎn)生較多的醋酸；在乳酸菌制劑發(fā)酵中的乳酸含量上升速度明顯高于其他兩種方式。

琥珀酸含量在3種發(fā)酵方式中均呈前期上升后期下降的趨勢，自然、乳酸菌發(fā)酵方式的變化趨勢基本相似，發(fā)酵至第4天上升至最高值，分別為(0.727±0.053)，(0.690±0.013) mg/mL，之后又呈下降趨勢，而老泡菜水發(fā)酵方式發(fā)酵至第2天上升至最高值(0.529±0.025) mg/mL后趨于下降，第8天后未檢出。

DL-蘋果酸含量在3種發(fā)酵方式中均呈現(xiàn)波動式的變化趨勢，由第0天的(1.582±0.015)，(1.183±0.014)，(1.527±0.026) mg/mL下降至第10天的(1.269±0.025)，(1.159±0.056)，(1.196±0.061) mg/mL。

草酸、乙酸含量在乳酸菌制劑發(fā)酵中均顯著高于其他兩種方式(p<0.05)。

2.5.3 泡菜中有機(jī)酸總量的分析

3種發(fā)酵方式下蘿卜泡菜在第0～10 d的有機(jī)酸總量變化見圖2。

圖2 3種發(fā)酵方式下泡菜中有機(jī)酸總量的變化Fig.2 The changes in total amount of organic acids in pickles by three fermentation methods

由圖2可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，自然、乳酸菌制劑、老泡菜水3種發(fā)酵方式有機(jī)酸總量均呈下降趨勢，分別由第0天的(312.044±0.077)，(316.807±0.070)，(292.193±0.063) mg/mL下降至第10天的(117.665±0.068)，(122.773±0.061)，(108.951±0.143) mg/mL，并且第0～4 d下降趨勢明顯，第4～6 d下降趨勢平緩；發(fā)酵過程中，乳酸菌制劑發(fā)酵的有機(jī)酸總量始終高于其他兩種方式。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對自然、老泡菜水和乳酸菌制劑3種發(fā)酵方式制作的蘿卜泡菜在第0～10 d的7種有機(jī)酸進(jìn)行定性定量分析，得出以下結(jié)論：

3種發(fā)酵方式中，草酸含量均呈下降趨勢，第0～6 d下降變化顯著，第6天后下降速度趨于平緩；乳酸、乙酸含量均呈上升趨勢，乳酸含量上升速度明顯高于乙酸，乳酸菌制劑發(fā)酵中乳酸含量的上升速度明顯高于其他兩種方式，乙酸含量在乳酸菌制劑發(fā)酵方式中均高于其他兩種方式；酒石酸含量均呈先下降后上升趨勢，在第0～8 d下降趨勢顯著，并且乳酸菌制劑發(fā)酵的下降幅度明顯低于其他兩種方式，第8天后上升趨勢顯著；琥珀酸含量均呈先上升后下降趨勢，自然乳酸菌發(fā)酵方式在第4天上升至最高值后開始下降，而老泡菜水發(fā)酵方式在第2天上升至最高值后下降，第8天后未檢出；檸檬酸含量在自然、乳酸菌制劑發(fā)酵方式中呈先下降后上升趨勢，而在老泡菜水發(fā)酵中，發(fā)酵至第2天以后均未檢出；DL-蘋果酸含量在3種發(fā)酵方式中均呈波動式的變化趨勢。

7種有機(jī)酸總量在3種發(fā)酵方式中均呈下降趨勢，且第0～4 d下降趨勢明顯，第4～6 d下降趨勢平緩，在整個發(fā)酵過程中，乳酸菌制劑發(fā)酵方式始終高于自然和老泡菜水的發(fā)酵方式。