任 琦 萬(wàn)林春 蔡靖波 徐 蘭 陳 希*

(1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○八醫(yī)院藥學(xué)科，江西 南昌 330002)

柏子養(yǎng)心丸處方來(lái)源于《古今醫(yī)統(tǒng)》卷七葉引《集驗(yàn)方》，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2020版一部，由炙黃芪、黨參、柏子仁、醋五味子等十三味藥組成。具有安神、補(bǔ)氣、養(yǎng)血之功效。用于失眠、多夢(mèng)、健忘、心悸易驚等癥[1，2]。方中醋五味子是取凈五味子，照醋蒸法蒸至黑色，來(lái)源為北五味子，《中國(guó)藥典》2020版一部同時(shí)收錄了五味子及南五味子。五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱“北五味子”[3]；南五味子為木蘭科植物華中五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils．的干燥成熟果實(shí)[4]。兩者皆具收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心之功效，用于久嗽虛喘、夢(mèng)遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、心悸失眠。在臨床應(yīng)用中，南北五味子均統(tǒng)稱為五味子[5]，在處方用藥上較為混亂。由于南、北五味子的市場(chǎng)價(jià)位相差較大，北五味子的價(jià)格為南五味子的十多倍，這導(dǎo)致將南五味子代替北五味子投料或者往北五味子投入部分南五味子現(xiàn)象加重，嚴(yán)重影響了柏子養(yǎng)心丸的有效性、安全性。而柏子養(yǎng)心丸現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅有五味子的顯微鑒別，未對(duì)其特征性成分加以控制，難以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量[6]，且目前未見(jiàn)有關(guān)柏子養(yǎng)心丸中五味子摻偽研究的報(bào)道。為了有效的控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證其安全性和有效性，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法建立了柏子養(yǎng)心丸中的五味子中特征性成分五味子醇甲的含量測(cè)定[7-10]，為科學(xué)評(píng)價(jià)及有效控制柏子養(yǎng)心丸的五味子真實(shí)投料提供可靠方法。

1 儀器與試樣

1.1 儀器

安捷倫Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；Sartorius BT 25S電子天平(德國(guó)賽多利斯公司，十萬(wàn)分之一)；Sartorius BSA 124S-CW電子天平(德國(guó)賽多利斯公司，萬(wàn)分之一)。

1.2 試藥與樣品

試藥：五味子醇甲對(duì)照品(以99.4%計(jì))中檢院提供，批號(hào)：110827-201412；甲醇、乙腈為色譜純、水為Milli-Q制備的超純水；冰醋酸及其他試劑均為分析純。

樣品：柏子養(yǎng)心丸，來(lái)源為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)工作柏子養(yǎng)心丸品種抽驗(yàn)樣品，共抽取樣品224批次，涉及生產(chǎn)企業(yè)49家。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters sunfire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.1%冰醋酸溶液，進(jìn)行梯度洗脫(見(jiàn)表1)；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm；柱溫為35 ℃；流速為1 mL·min-1。在上述色譜條件下，五味子醇甲與其他組分的色譜峰分離度良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

注：A.五味子醇甲對(duì)照品溶液；B.五味子藥材溶液；C.南五味子藥材溶液；D.柏子養(yǎng)心丸供試品溶液；E.缺醋五味子陰性對(duì)照溶液圖1 HPLC含量測(cè)定色譜圖

2.2 溶液配制

對(duì)照品溶液的制備：取五味子醇甲對(duì)照品適量，精確稱量，加50%乙醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取本品6 g(水蜜丸研碎；小蜜丸或大蜜丸剪碎)，精確稱量，精密加50%乙醇25 mL，置具塞錐形瓶中，稱量重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱量重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，用微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系的考察

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：取五味子醇甲對(duì)照品10.52 mg，精確稱量，置100 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：標(biāo)準(zhǔn)溶液①：精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，加50%乙醇稀釋至2 mL，搖勻，即得；標(biāo)準(zhǔn)溶液②：精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，加50%乙醇稀釋至5 mL，搖勻，即得；標(biāo)準(zhǔn)溶液③：精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，加50%乙醇稀釋至10 mL，搖勻，即得；標(biāo)準(zhǔn)溶液④：精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，加50%乙醇稀釋至20 mL，搖勻，即得；標(biāo)準(zhǔn)溶液⑤：精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，加50%乙醇稀釋至100 mL，搖勻，即得。精確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液①～⑤五各20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為：y=6111.7432x+0.1541，R2=1.0000。表明五味子醇甲在0.0209 μg～1.0457 μg之間呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

精確吸量按2.3.1項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)溶液②20 μL，在2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果五味子醇甲峰面積的RSD為0.3%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批柏子養(yǎng)心丸樣品6份，每份約6 g，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，五味子醇甲的含量的平均值為102.2 μg·g-1，RSD為0.9%，表明該方法有良好的重現(xiàn)性。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精確吸取同一供試品溶液20 μL，分別于0 h，2 h，4 h，12 h，24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得五味子醇甲峰面積的RSD為0.3%(n=6)，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，精確稱量已知含量(五味子醇甲含量為102.2 μg·g-1)的柏子養(yǎng)心丸樣品6份，每份約3 g，加入含五味子醇甲12.2262 μg·mL-1的對(duì)照品溶液25 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果五味子醇甲的平均回收率為106.0%(n=6)，RSD為0.8%。見(jiàn)表2。

表2 五味子醇甲回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品測(cè)定及結(jié)果

分別224批次柏子養(yǎng)心丸樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。吸取供試品溶液20 μL，在2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算出五味子醇甲的含量。按照《中國(guó)藥典》2020年版一部醋五味子項(xiàng)下規(guī)定，醋五味子含五味子醇甲(C24H32O7)計(jì)不得少于0.40%。本品醋五味子為原粉入藥，根據(jù)本品處方與制法，按照80%轉(zhuǎn)化率進(jìn)行折算，將限度擬定為：本品含醋五味子以五味子醇甲(C24H32O7)計(jì)，水蜜丸每1 g不得少于70 μg；小蜜丸、大蜜丸每1 g不得少于43 μg。根據(jù)這一限度，共有34批不符合規(guī)定。其中共有4個(gè)企業(yè)合計(jì)12批柏子養(yǎng)心丸中五味子醇甲未檢出；另共有3家企業(yè)22批次樣品五味子醇甲含量偏低。

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

采用DAD檢測(cè)器對(duì)五味子醇甲對(duì)照品色譜峰進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果五味子醇甲在215 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，由于215 nm雜峰對(duì)目標(biāo)峰干擾少且穩(wěn)定，故選擇215 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 提取方法的選擇

比較了加熱回流提取，超聲提取兩種提取法，考慮操作方便并節(jié)省時(shí)間，故確定本品提取方法為超聲處理。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中比較了提取時(shí)間(15 min、30 min、60 min、90 min)及提取溶劑(50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇)，結(jié)果表明，提取溶劑倍量為提取時(shí)間為30 min和提取溶劑為50%乙醇時(shí)能將五味子醇甲完全提取，作為最終提取方法。

3.3 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)摸索乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%冰醋酸溶液和甲醇-0.1%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相，考察其分離度，以甲醇-0.1%冰醋酸溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。流速1.0 mL·min-1，柱溫35 ℃的色譜條件下供試品中五味子醇甲與其他共存組分峰能達(dá)到良好的分離。

本實(shí)驗(yàn)建立了柏子養(yǎng)心丸中五味子醇甲的HPLC含量測(cè)定方法研究柏子養(yǎng)心丸中五味子的摻偽情況。通過(guò)圖1可知五味子醇甲為五味子的特征性成分，南五味子不含五味子醇甲，通過(guò)該成分可有效地區(qū)分五味子、南五味子。目前探索性研究發(fā)現(xiàn)部分生產(chǎn)企業(yè)樣品未檢出五味子醇甲，提示這些企業(yè)對(duì)五味子藥材含量測(cè)定項(xiàng)可能未進(jìn)行檢驗(yàn)即投入生產(chǎn)或使用五味子混淆品投產(chǎn)或五味子投料量不足，嚴(yán)重違反了GMP有關(guān)管理規(guī)定，提示生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)自律，應(yīng)嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生產(chǎn)。