劉兆祿，朱力，潘超，盧瑛，王恒樑，

1.上海海洋大學(xué)，上海201306；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京100071

百日咳是由百日咳博德特菌引起的急性呼吸道傳染病，其最早于1414年在法國出現(xiàn)，也是世界上使用疫苗控制效果較差的可預(yù)防疾病之一［1］。百日咳的臨床特征為陣發(fā)性或暴發(fā)性的多次快速咳嗽，并伴有特征性的“雞鳴”樣吸氣性吼聲，最常見的并發(fā)癥是繼發(fā)性肺炎。該病多發(fā)于兒童及嬰幼兒年齡段，特別是小于6個(gè)月的嬰兒［2］。盡管目前已有針對(duì)百日咳的預(yù)防性疫苗且疫苗接種率高，但百日咳仍為兒童死亡的主要病因之一。

天然的絲狀血凝素（filamentous haemagglutinin，F(xiàn)HA）是在細(xì)菌細(xì)胞表面表達(dá)的百日咳博德特菌黏附素，也會(huì)分泌到細(xì)胞外環(huán)境中，其包含幾個(gè)促進(jìn)細(xì)菌黏附于纖毛呼吸道上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)域，包括保守的三肽序列RGD（Arg-Gly-Asp）、碳水化合物識(shí)別結(jié)合域和肝素結(jié)合域［3］。FHA通過RGD與巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞表面的3型補(bǔ)體受體（type 3 complement receptor，CR3）結(jié)合來啟動(dòng)吞噬作用，然后毒素介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)殺傷抑制作用可促進(jìn)細(xì)菌存活［4］。為探究FHA最具免疫原性的區(qū)域，ASGARIAN-OMRAN等［5］通過人血清抗體對(duì)FHA不同區(qū)域進(jìn)行測(cè)定，證明在FHA氨基酸殘基1877-2250位置能夠誘導(dǎo)最有效的免疫應(yīng)答，是FHA最具免疫顯性的區(qū)域。

志賀毒素B亞單位（shiga toxin B subunit，StxB）早期即被證實(shí)可作為載體蛋白在輪狀病毒抗原刺激小鼠后提供保護(hù)性黏膜體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)［6］。StxB作為抗原載體與特定細(xì)胞表面受體結(jié)合，使樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）以受體介導(dǎo)的內(nèi)吞方式高效攝取抗原蛋白，顯著活化初始T細(xì)胞進(jìn)行增殖。同時(shí)，StxB還為抗原提供了更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，更利于抗原提呈及淋巴結(jié)引流，有效誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答。因此，在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，StxB已成為亞單位疫苗有效的載體之一。

本研究以百日咳FHA氨基酸殘基1877-2250片段與StxB作為融合蛋白構(gòu)建亞單位疫苗，并分析其免疫原性和免疫保護(hù)效果，為百日咳疫苗的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及FHA片段StxB序列載體及表達(dá)載體pET-28a（+）由軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所八所二室保存；感受態(tài)大腸埃希菌DH5α、BL21（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；百日咳Bp148株菌由北京兒童醫(yī)院姚開虎教授惠贈(zèng)；FHA氨基酸殘基1877-2250片段由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)BALB／c小鼠，5～6周齡，雌性，體重18 g，購自北京維通利華公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，使用許可證號(hào)：1100111911040351。在軍事醫(yī)學(xué)研究院動(dòng)物中心（AAALAC認(rèn)證）根據(jù)國家科技部《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》飼養(yǎng)。

1.3 主要試劑T4 DNA連接酶和DNA marker購自日本TaKaRa公司；蛋白定量試劑盒、EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶購自美國Thermo Fisher Scientific公司；IPTG購自美國Amresco公司；氫氧化鋁佐劑購自美國Sigma-Aldrich公司；10×TBS、PCR2×Super Pfx MasterMix酶、質(zhì)粒提取試劑盒和PCR產(chǎn)物回收試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；HRP-Anti-6×His tag購自上海Abmart生物醫(yī)藥有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京TransGen Biotech有限公司；兔源補(bǔ)體由中國食品藥品檢定研究院提供；無水甲醇、甘氨酸和Tris購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成 通過DNAclub軟件設(shè)計(jì)合適的引物擴(kuò)增StxB和FHA1877-2250片段，并在StxB的3′端和FHA1877-2250的5′端添加一段接頭蛋白GGGS序列（GGCGGATCCGGC）將兩個(gè)片段連接在一起。FHA1877-2250片段引物序列：FHA-F1：5′-CGGAATTCGACGAGCACCGTCACCTGCTGAACG-3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），F(xiàn)HA-R1：5′-GCCTCGAGACCATCCGCCAGGCTGGTCTGC-3′（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段大小為1 134 bp。StxB片段引物序列：StxB-F1：5′-CGGAATTCATGAAAAAAACATTATTAATAGCTGC-3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），StxB-R1：5′-ACGAAAAATAACTTCGCTGAATCCCCCTCC-3′，擴(kuò)增片段大小為267 bp。所有引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.5 各目的片段的擴(kuò)增 以帶有FHA1877-2250片段的質(zhì)粒為模板，利用引物FHA-F1和FHA-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性6 min；95℃變性30 s，58℃退火25 s，72℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)；72℃終延伸8 min。以帶有StxB片段的質(zhì)粒為模板，利用引物StxB-F1和StxB-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性6 min；95℃變性30 s，58℃退火15 s，72℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)；72℃終延伸8 min。以擴(kuò)增片段StxB和FHA1877-2250為模板，通過引物StxBF1和FHA-R1擴(kuò)增融合片段StxB-Fha1877-2250。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性6 min；95℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)；72℃終延伸8 min。擴(kuò)增片段均經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將StxB-Fha1877-2250、FHA1877-2250片段和載體pET-28a（+）分別經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收，通過T4 DNA連接酶連接，分別構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-StxB-Fha1877-2250和pET-28a-FHA1877-2250。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，涂布于含卡那霉素（50μg／mL）的LB平板，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆，經(jīng)PCR驗(yàn)證，陽性單克隆送天一輝遠(yuǎn)公司測(cè)序，驗(yàn)證引物序列：FHA-F：5′-GCAACGTTGGAAGGATTTCAAAGCGG-3′，T7-Ter-R：5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′。

1.7 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的重組表達(dá) 質(zhì) 粒pET-28a-StxB-Fha1877-2250、pET-28a-FHA1877-2250轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3），涂布于含卡那霉素（50μg／mL）的LB平板上，隔夜挑取單克隆，接種于含卡那霉素（50μg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中，置28℃，220 r／min振蕩搖床中培養(yǎng)至A600值達(dá)0.6左右時(shí)，加入終濃度為1 mmol／L的IPTG誘導(dǎo)12 h，取1 mL菌體，加入90μL ddH2O重懸，再加入90μL 2×SDS Buffer充分混勻，沸水浴10 min，進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定 表達(dá)的重組蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用封閉液（1 g脫脂奶粉加入20 mL TBST）于37℃恒溫箱中封閉1.5 h；加入His-tag抗體（1∶5 000稀釋），37℃孵育1 h；1×TBST清洗3次，每次8 min，在顯影儀上顯影。設(shè)置顯影曝光時(shí)間為15 min。

1.9 重組蛋白的純化與復(fù)性 培養(yǎng)500 mL表達(dá)菌，離心棄上清，將菌體沉淀用上樣緩沖液A1（0.5 mol／L NaCl，13.3 mL Tris-HCl，0.1 mmol／L Imidazole，pH 7.5）重懸，用細(xì)胞破碎儀破碎菌體，離心取破碎沉淀，用含尿素的緩沖液A2（0.5 mol／L NaCl，13.3 mL／L Tris-HCl，0.1 mmol／L Imidazole，8 mol／L Urea，pH 7.5）重懸菌液，待破碎菌體完全溶解后，6 941×g離心10 min，取上清進(jìn)行純化。將鎳柱用10倍柱體積的緩沖液A2進(jìn)行平衡，再將蛋白樣品用4 mL／min的流速上樣，最后以5倍柱體積的洗脫液（0.5 mol／L NaCl，13.3 mL／L Tris-HCl，8 mol／L Urea，0.5 mol／L Imidazole，pH 7.4）洗脫，收集目的蛋白。洗脫后的蛋白加入透析袋中，4℃環(huán)境下復(fù)性，復(fù)性后蛋白最終透析于儲(chǔ)存液1×PBS（pH 8.0）溶液6～8 h。透析復(fù)性結(jié)束后，上清用0.22μm濾器過濾后分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 動(dòng)物分組及免疫 將30只健康BALB／c小鼠隨機(jī)分為3組：StxB-Fha1877-2250、FHA1877-2250和對(duì)照組，每組10只。前兩組免疫蛋白2.5μg／只+1／10體積的氫氧化鋁佐劑，免疫劑量為100μL／只，對(duì)照組免疫等體積的PBS。所有小鼠均經(jīng)皮下免疫3次，間隔2周。末次免疫后10 d經(jīng)尾靜脈采血，4℃隔夜后5 039×g離心7 min分離血清，測(cè)定小鼠血清抗體水平。

1.11 小鼠血清抗體水平的檢測(cè) 采用間接ELISA法。以帶有GST標(biāo)簽的FHA1877-2250蛋白作為包被抗原，加入96孔板，100μL／孔，含GST-Fha1877-2250蛋白10μg，4℃包被過夜；次日用TBST洗滌3次，加入5%脫脂牛奶，37℃封閉1 h；加入倍比稀釋的小鼠血清，37℃孵育1 h；用PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶20 000稀釋），37℃孵育1 h；用PBST洗滌3次，加入TMB溶液，避光顯色15 min；加入終止液H2SO4終止5 min后，用酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)490 nm處吸光度值。以對(duì)照組小鼠血清平均A490值的2.1倍為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算免疫動(dòng)物抗體滴度。

1.12 血清體外殺菌試驗(yàn) 將百日咳Bp148株培養(yǎng)至A600為2.0時(shí)，用生理鹽水稀釋至菌濃度為100～200 CFU／10μL，取10μL稀釋的菌液，與倍比稀釋的10μL血清（預(yù)先58℃水浴30 min，以滅活其中的補(bǔ)體成分）混合，37℃孵育1 h；加入20μL補(bǔ)體充分混勻，37℃孵育1 h；全部涂LB平板，37℃溫箱培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)平板菌落總數(shù)，計(jì)算殺菌率。

1.13 動(dòng)物攻毒保護(hù)試驗(yàn) 末次免疫后第14天，對(duì)3組小鼠腹腔接種2倍半數(shù)致死劑量（1.21×108CFU）的百日咳Bp148株菌液，感染后觀察14 d，統(tǒng)計(jì)小鼠死亡情況。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Graphpad Prism 7.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)，方差不齊經(jīng)Welch矯正分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定StxB、FHA1877-2250、StxB-Fha1877-2250片段的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別可見約250、1 100和1 500 bp的特異條帶，大小均與預(yù)期一致，見圖1。

圖1 StxB、FHA1877-2250、StxB-Fha1877-2250基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of StxB，F(xiàn)HA1877-2250 and StxB-Fha1877-2250 genes

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET-28a-StxB-Fha1877-2250和pET-28a-FHA1877-2250的單克隆均可擴(kuò)增出351 bp的特異片段，與理論序列大小一致，見圖2。陽性單克隆的StxBFha1877-2250測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的cDNA序列（BX470248.1）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果100%同源，表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定12%SDS-PAGE分析顯示，與未誘導(dǎo)菌相比，誘導(dǎo)菌在相對(duì)分子質(zhì)量約43 000、51 000處有明顯表達(dá)的蛋白條帶，與目的蛋白FHA1877-2250、StxB-Fha1877-2250的預(yù)測(cè)值相符。Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證了目的蛋白表達(dá)正確。見圖3。

2.4 純化產(chǎn)物的鑒定 復(fù)性后的蛋白經(jīng)12% SDSPAGE分析，純度超過98%，見圖4。經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)，純化后StxB-Fha1877-2250蛋白含量為399.36μg／mL，F(xiàn)HA1877-2250蛋白含量為269.79μg／mL。

2.5 免疫小鼠抗體水平 間接ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，末次免疫后第10天，StxB-Fha1877-2250和FHA1877-2250組小鼠均能產(chǎn)生抗FHA的特異性抗體，抗體效價(jià)與對(duì)照相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為17.92和20.43，P均<0.000 1），且StxB-Fha1877-2250組相比于FHA1877-2250組能夠產(chǎn)生更高水平的特異性抗體（F=3.81，P=0.001 7），見圖5。表明重組蛋白StxBFha1877-2250免疫小鼠后能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性B細(xì)胞免疫應(yīng)答。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證Fig.2 Verification of recombinant plasmid by PCR

圖3 重組蛋白的SDS-PAGE（A）及Western blot（B）鑒定Fig.3 SDS-PAGE（A）and Western blot（B）profiles of recombinant proteins

圖4 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE profile of purified recombinant proteins

圖5 ELISA檢測(cè)各組免疫小鼠血清中的抗體滴度Fig.5 Determination of serum antibody titers of mice in various groups by ELISA

2.6 血清體外殺菌活性StxB-Fha1877-2250和FHA1877-2250組初始濃度的血清幾乎可達(dá)到80%的殺菌效果，但當(dāng)血清稀釋至80倍后，殺菌效果明顯下降，兩組血清的殺菌效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.435，P=0.1850），但StxB-Fha1877-2250組的血清殺菌效率比FHA1877-2250組略好。見圖6。

2.7 動(dòng)物攻毒保護(hù)效果 攻毒18 h后，小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡等癥狀；24 h后，3組小鼠開始死亡；72 h后，對(duì)照組小鼠全部死亡，而FHA1877-2250組小鼠在4 d內(nèi)有6只死亡，StxB-Fha1877-2250組小鼠有4只死亡，其余小鼠在經(jīng)歷萎靡不振后慢慢恢復(fù)健康。StxB-Fha1877-2250和FHA1877-2250組小鼠小鼠存活率與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.000 5和0.004 0）；StxB-Fha1877-2250組與FHA1877-2250組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.363 5）。見圖7。表明融合蛋白StxB-Fha1877-2250具有較好的潛在保護(hù)效果，有效保護(hù)率為60%。

圖6 不同稀釋度血清補(bǔ)體殺菌活性Fig.6 Complement bactericidal activity of serum at different dilutions

圖7 攻毒后各組小鼠的存活情況Fig.7 Survival of immunized mice after challenge

3 討論

通過疫苗接種獲得的免疫不是終生的，其保護(hù)效果在4～10年內(nèi)趨于減弱，使現(xiàn)今百日咳的發(fā)病率重新升高。因此，開發(fā)新一代疫苗需進(jìn)一步研究百日咳博德特菌的發(fā)病機(jī)制和疫苗的免疫效果［7］。亞單位疫苗免疫原性低是普遍存在的問題，進(jìn)入機(jī)體后無法產(chǎn)生充分刺激，對(duì)免疫系統(tǒng)激活能力差，可采用多種疫苗提送系統(tǒng)（如胞外囊泡［8］、自組裝蛋白納米顆粒［9］、病毒樣顆粒［10］等）促進(jìn)抗原更高效地被抗原提呈細(xì)胞識(shí)別與遞送，激發(fā)T細(xì)胞依賴的免疫應(yīng)答，相關(guān)研究也在進(jìn)行中。

作為百日咳博德特菌的主要外膜蛋白，F(xiàn)HA不僅豐度較高，同時(shí)也是現(xiàn)今百日咳無細(xì)胞疫苗（acelluar pertussis vaccine，apv）的主要組成成分。本實(shí)驗(yàn)將StxB片段構(gòu)建至FHA1877-2250N-端進(jìn)行融合表達(dá)，純化的StxB-Fha1877-2250蛋白免疫動(dòng)物后用Bp146菌株攻擊對(duì)其免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，F(xiàn)HA1877-2250組小鼠的保護(hù)率達(dá)40%，即單一的FHA1877-2250抗原能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)，與ASGARIANOMRAN等［5］報(bào)道一致；在此基礎(chǔ)上，融合了StxB的StxB-Fha1877-2250組保護(hù)率又有所提高，達(dá)60%。雖然在之后的體外殺菌試驗(yàn)中兩組并無明顯差異，但通過間接ELISA檢測(cè)的StxB-Fha1877-2250抗體效價(jià)最高可達(dá)1∶3 200，證實(shí)StxB與FHA1877-2250融合有助于提高單抗原的免疫原性和免疫保護(hù)性。

通常，關(guān)于StxB蛋白制備的信息很少，且多數(shù)報(bào)道與StxB融合蛋白有關(guān)［11］。這種小尺寸蛋白質(zhì)在原核宿主微生物（包括大腸埃希菌）中包含3個(gè)二硫鍵，因此其作為包涵體以非活性和不溶性蛋白產(chǎn)生。當(dāng)在大腸埃希菌中過表達(dá)時(shí)，由于包涵體的形成，在隨后的進(jìn)一步處理中最終獲得的StxB數(shù)量可能會(huì)受到限制。另外，大腸埃希菌自然產(chǎn)生高度免疫原性的內(nèi)毒素，也會(huì)限制這種材料的應(yīng)用。雖然目前已開發(fā)了不產(chǎn)生內(nèi)毒素的大腸埃希菌系統(tǒng)［12-13］，但還需更多驗(yàn)證來確定它們是否適用于生產(chǎn)StxB片段?？偟膩碚f，生物技術(shù)生產(chǎn)StxB片段或由StxB片段和具有特定功能的蛋白質(zhì)組成更復(fù)雜的融合蛋白在技術(shù)上是可行的［14］。

總之，基于StxB的藥物遞送系統(tǒng)具有將小分子和大分子藥物遞送至細(xì)胞內(nèi)的載體潛力。多抗原組合或融合表達(dá)有利于研發(fā)多樣性的亞單位疫苗，是開發(fā)廣譜疫苗的研究思路。因此，篩選結(jié)構(gòu)更為保守、免疫原性更好的抗原與適合的載體進(jìn)行融合或組合，將對(duì)百日咳亞單位疫苗的研究帶來幫助。本實(shí)驗(yàn)以百日咳FHA1877-2250蛋白為研究對(duì)象，成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒，并經(jīng)純化復(fù)性獲得百日咳StxBFha1877-2250融合蛋白。通過動(dòng)物試驗(yàn)、間接ELISA及體外殺菌試驗(yàn)證實(shí)，StxB-Fha1877-2250蛋白具有更良好的免疫原性和反應(yīng)原性，可作為具有潛力的百日咳亞單位疫苗之一。